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兔病毒性出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)主要引起兔的一种急性、烈性、高度传染性和高度死亡性的疾病,由于感染该病毒后会导致患兔多器官的出血充血,而将该病称为兔病毒性出血症(rabbit hemorrhagic disease,RHD)。本试验对RHDV VP60截段基因进行原核表达,基于重组蛋白对胶体金及量子点免疫层析试纸条进行初步探索研究。1.RHDV VP60截段基因的原核表达根据Gen Bank RHDV基因序列,通过RT-PCR扩增VP60基因(901bp-1740bp),连接至p MD19-T克隆载体,经测序鉴定后,酶切、连接构建重组表达质粒p Cold TF-VP60-2,转化到大肠杆菌BL21(DE3),经PCR、酶切以及测序鉴定后的阳性菌扩大培养,用IPTG(1 mmol/L)进行诱导表达,进行SDS-PAGE分析、Western-blotting鉴定以及亲和层析法纯化蛋白ELISA检测。结果显示重组质粒构建成功,表达的重组蛋白为82.8 k Da,并优化确定了37℃、0.2 mmol/L、诱导6 h为最佳诱导表达条件,经亲和层析法可获得5.16mg/m L纯化重组蛋白,包被重组蛋白的间接ELISA结果表明表达的重组蛋白能与兔抗RHDV抗体特异性结合,具有良好的反应原性。2.RHDV抗体检测胶体金免疫层析试纸条的试制制备兔抗重组蛋白抗体,胶体金标记重组蛋白点样金标垫,兔抗重组蛋白多克隆抗体标记C线,羊抗兔IgG标记T线,设计RHDV抗体检测试纸条,通过T线和C线抗体用量的优化,特异性和敏感性试验,初步试制了RHDV抗体检测的免疫胶体金试纸条,对5份试验免疫血清样品、5份未免疫抗体阴性血清以及临床采样154份免疫过的血清进行试验。结果显示研制的胶体金试纸条具有良好的灵敏性和特异性,其免疫血清灵敏度可达到1:16,特异性检测在兔抗RHDV血清时T线出现了红色条带,兔产气荚膜梭菌A型血清及兔巴氏杆菌等血清在T线未见显色条带,5份阳性样品全部为阳性,5份未免疫血清均为阴性,用设计的RHDV抗体试纸条检测临床采样的154份样品,结果显示150份为阳性,4份为阴性,为RHDV抗体水平监测提供一种可用的免疫试纸条。3.RHDV抗体检测的量子点免疫层析试纸条的试制量子点标记重组蛋白为金标垫,兔抗重组蛋白多克隆抗体标记C线,羊抗兔IgG标记T线,设计RHDV抗体检测试纸条,通过T线和C线抗体用量的优化,特异性和敏感性试验及样品检测应用,初步试制了可用于RHDV抗体检测的量子点免疫层析试纸条。结果显示试制的量子点免疫层析试纸条具有良好的灵敏性和特异性,其免疫血清灵敏度可达到1:32,特异性检测在兔抗RHDV血清时T线出现了荧光条带,阴性血清及兔巴氏杆菌等血清在T线未见显色条带,5份阳性样品全部为阳性,5份未免疫血清均为阴性,用设计的RHDV抗体量子点试纸条检测临床采样的154份样品,结果显示150份为阳性,4份为阴性,与胶体金免疫层析试纸条检测结果相符合,同时为量子点免疫层析试纸条进一步研制奠定了基础。