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前言 1型糖尿病（diabetes mellitus，DM）是胰岛细胞自身免疫破坏的结果，近年来的实验研究表明：细胞因子（cytokines，CK）引起的胰岛细胞损伤在1型DM的发病中起重要作用，但对其机制尚不明确，大量证据表明细胞程序性死亡（凋亡）是1型DM胰岛细胞死亡的主要形式。Zumsteg等实验证实，一氧化氮（NO）合成和FAS／FAS特异性配体（FASL）的相互作用是CK致鼠胰岛细胞损伤的两个独立途径，且高浓度NO是CK致胰岛细胞损伤的终末效应因子。白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）单独或联用肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）可诱导鼠或人胰岛细胞诱生型NO合成酶（iNOS）基因转录，催化NO合成，最终导致胰岛细胞损伤。环磷酸腺苷（cAMP）被普遍认为是胰岛素（insulin，Ins）分泌的一个重要放大器，那些通过刺激腺苷酸环化酶或抑制cAMP磷酸二酯酶（phosphodiesterase，PDE）的药物可极大的增加葡萄糖诱导的Ins分泌。目前将cAMP PDEs分为PDE1～PDE11共11类，国外实验已证实胰岛细胞同时表达PDE3和PDE4，但此两型抑制剂对抑制胰岛细胞NO的合成，升高cAMP水平还没有深入的研究。 本实验将采用离体培养的雄性Wistar大鼠胰岛细胞，进一步研究IL-1β对胰岛细胞的损伤作用及特异性Ⅲ型PDE抑制剂（西洛酰胺，Cilostamide，CIL）、特异性Ⅳ型PDE抑制剂（咯利普兰，Rolipram，ROL）对胰岛细胞的防护作用及其机制。 实验材料 一、药品与试剂 （1）IL-1β、CIL、ROL购自上海康成生物工程有限公司； （2）Ⅴ型胶原酶、NO试剂盒、胰岛素放免分析药盒购自北京邦定泰克生物技术有限公司； （3）’251一cAMP放免试剂盒购自上海中医药大学同位素室; （4）RPMI一1640培养液购自郑州华美生物制品有限公司; （5）胎牛血清白蛋白、四哇盐（M竹）、二甲基亚矾（DMSO）为sigrna公司产品（细胞生物教研室惠赠）。 二、实验动物 Wistar雄性大鼠购自中国医科大学动物实验中心。 三、实验仪器 相差显微镜、超净台、二氧化碳培养箱、滤器、细胞计数板、分光光度仪（日本岛津UV 160）等。实验方法 1.胰岛细胞的分离及培养: 雄性Wistar大鼠，体重100一1509，于无菌条件下取出胰腺，洗净剪碎用Hanks液充分漂洗后，置于含有1 .0群LV型胶原酶的Hanks液中，38℃水浴静止消化23而n左右。小心弃去上层胶原酶溶液，迅速加人等量含1.鲍几胎牛血清白蛋白的4℃RpMI一1640培养液清洗两次，离心去上清后加人Hanks液用吸管吹打成细砂样，80目不锈钢筛网过滤。收集胰岛细胞团滤液，100 xg离心10分钟后收集胰岛细胞团，加人含10%胎牛血清、2岁L葡萄糖、looIU/而青霉素、100m扩耐链霉素的RPMI一1640培养液后移入100而玻璃培养瓶中，置37℃、5%CO:的二氧化碳培养箱中，隔天换液，培养96小时后胰岛细胞团基本分离成良好的单个胰岛细胞。100 xg离心10分钟收集胰岛细胞，制成细胞浓度为6.5 x 105/耐的胰岛细胞悬液后移人24孔培养板中，每孔胰岛细胞数为6.5 x 105。 2.细胞分组及测定方法: 将上述胰岛细胞分为以下九组（每组n二5）: （l）正常组 （2）30U/rnllL一lp组 （3）30U/InllL一lp、200nunoULCIL组 （4）30U/InllL一lp、400mmol/LCIL组 （5）30U/成L一lp、600mmol/比IL组 （6）30U/InllL一lp、sonunoFLROL组 （7）3OU/rnllL一lp、100nunoFLROL组 （8）3OU/tnllL一lp、200nunol/LROL组 （9）30U/恤L一lp、200nunoFLCIL、50Inlnol/LROL组 上述各组胰岛细胞培养24小时后，分别取上清液lood进行以下实验 NO测定:通过分光光度法测定上清液NO代谢产物亚硝酸盐累积量来反映一定时间内NO的合成量。 cAMP水平测定:采用‘气一CAMP放免试剂盒测定上清液中CAMP含量。 Ins测定:采用放免法测定Ins含量。 细胞增殖活性测定:采用M，IT比色法。 3.统计学处理:采用SPSS 11 .0统计软件包，单因素方差分析及线性回归，t检验分析。实验结果 1 .IL一lp（30U/耐）能显著增加离体培养的雄性Wistar大鼠胰岛细胞的NO合成（P<0.01），同时对cAMP水平，Ins分泌及MTr值具有显著抑制作用（P值均<0.01），如表l所示。 2.不同浓度CIL均能显著抑制IL一lp诱导的离体雄性Wistar大鼠胰岛细胞的NO合成的增加及cAMP水平的下降，如表1所示，较高浓度CIL（600mm亦L）能显著增加hs分泌并升高M，I’r值（P值均<0.01），且随CIL浓度升高，对胰岛细胞NO合成的抑制作用逐渐增强，应用线性回归，t检验分析提示CIL抑制NO合成具有显著剂量依赖性（R，二0.44，p<0.01），如图l所示。 3.ROL随浓度升高，对IL一lp诱导的离体雄性Wistar大鼠胰岛细胞NO合成的抑制作用逐渐增强，如表1所示，但ROL仅于较高浓度（200mm0FL）时对抑制ILlp诱导的离体雄性Wistar大鼠胰岛细胞的NO合成的增加及cAMP水平的下降、Ins分泌的减少及M竹值的降低具有显著差异性（P<0.01），且亦呈现出显著剂量依赖性（r二0.56，p<0.01），如图2