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α-半乳糖苷酶(α-Galactosidase,α-D-Galactoside galactohydrolase,α-Gal; EC 3.2.1.22)也称蜜二糖酶,是一种外切糖苷酶。来源于咖啡豆的α-半乳糖苷酶具有将半乳糖转移到环糊精上的功能,从而酶法合成α-半乳糖基-环糊精。α-半乳糖基-环糊精是一种分支环糊精,具有广阔的应用前景。本文从发芽咖啡豆中分离纯化得到α-半乳糖苷酶,详细研究了该酶的酶学性质,酶法合成了α-半乳糖基-β-环糊精,并确定其结构。以培养35d的发芽咖啡豆为原料,冷冻24h(-40℃)后干法粉碎,提取液(水溶液:含有0.9%氯化钠,0.1mmol/L乙二胺四乙酸,pH4.8)粗提α-半乳糖苷酶。其它条件:料液比1:5,时间30min,搅拌速度100r/min。此条件下得到的α-半乳糖苷酶总酶活为132.60nkat,比酶活为6.44nkat/mg。采用响应面分析法优化粗提条件,优化后的条件:料液比1:5,时间35min,搅拌速度150r/min,pH 5.0。此条件下α-半乳糖苷酶总酶活为148.00nkat,比酶活为7.16nkat/mg,总酶活和比酶活都得到提高。α-半乳糖苷酶提取过程中,植物多酚造成严重的干扰,必须去除此物质。采用50%(V/V)丙酮去除粗提液中的植物多酚,去除率为76.4%,效果明显。去除植物多酚后,α-半乳糖苷酶总酶活为129.05nkat,比酶活为8.26nkat/mg。总酶活有所降低,但比酶活显著提高,有利于α-半乳糖苷酶的分离纯化。通过硫酸铵沉淀,DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱和Sephacryl S-200-HR凝胶过滤色谱等分离纯化技术,从发芽咖啡豆粗酶液中分离得到α-半乳糖苷酶。经过变性凝胶电泳分析,该酶出现单一谱带,分子量为38,805Da。经过分离纯化之后,发芽咖啡豆α-半乳糖苷酶的比酶活达到191.50nkat/mg,纯化倍数为23.18倍。以对硝基苯酚-α-半乳糖苷为底物,研究分离纯化后的发芽咖啡豆α-半乳糖苷酶的酶学性质。α-半乳糖苷酶的最适温度45℃,热稳定温度范围20-50℃,最适pH6.0,pH稳定范围5.0-7.0。Na+、K+、Mg2+和Cu2+对α-半乳糖苷酶的酶活影响不大,Zn2+促进酶活,Ba2+对酶活稍有抑制,Hg2+强烈抑制α-半乳糖苷酶的活性。在0-0.25mol/L离子强度(氯化钠)范围内,α-半乳糖苷酶的酶活不受影响。采用Lineweaver-Burk双倒数作图法,测定α-半乳糖苷酶的Km为0.556mmol/L,Vmax为1.19μmol/min。一定浓度条件下,化学修饰剂对α-半乳糖苷酶的化学修饰结果显示:色氨酸是α-半乳糖苷酶活性中心的必需氨基酸,-SH、-COOH和组氨酸对α-半乳糖苷酶的活性有影响,精氨酸、赖氨酸和-S-S-不是α-半乳糖苷酶活性中心的必需基团。邹氏作图法显示α-半乳糖苷酶活性中心的必需色氨酸数目为1。采用发芽咖啡豆α-半乳糖苷酶酶法合成分支环糊精。以蜜二糖(0.8mol/L)为供体,β-环糊精(0.4mol/L)为受体,反应缓冲液为醋酸缓冲液(50mmol/L, pH6.0),α-半乳糖苷酶用量为50nkat。反应条件:温度30℃,时间36h,振荡速度100 r/min。反应结束后,产品的高效液相色谱分析表明:有β-环糊精的衍生物生成。通过制备型高效液相色谱分离得到纯化样品。经过质谱分析和样品酶解产物的高效液相色谱分析,确定该样品为单取代的α-半乳糖基-β-环糊精。通过傅里叶变换红外光谱和核磁共振分析,得出α-半乳糖基-β-环糊精的结构:一个半乳糖通过α-1,6糖苷键与一个β-环糊精连接。α-半乳糖基-β-环糊精为单取代-6-O-α-D-半乳糖(吡喃)基-β-环糊精。通过发芽咖啡豆α-半乳糖苷酶酶法合成α-半乳糖基-β-环糊精动力学研究可以得到合适的参数:pH6.8,酶用量60nkat,β-环糊精0.4mol/L,蜜二糖0.8mol/L。由Plackett- Burman设计筛选出酶用量,时间和pH这三个影响α-半乳糖基-β-环糊精产量的主要因素。进一步通过最陡爬坡法和Box-Behnken设计,得到酶用量,时间和pH的最佳水平分别为73nkat,28h和6.3。其它条件:温度40℃,振荡速度75r/min,β-环糊精0.4mol/L,蜜二糖0.8 mol/L,反应体系为2mL醋酸缓冲液(50mmol/L)。在此条件下,α-半乳糖基-β-环糊精产量为28.4%,比优化前提高了41.3%。