研究背景我国是肝炎频发大国。重组人干扰素是目前国际上公认的有效治疗肝炎的药物,对于基因重组药物来说,药品的质量控制是我们关注的焦点,其中药品的鉴别实验是药品定性检测的主要依据。对于重组人干扰素来说,根据《中国药典》2015版三部,对重组人干扰素α2b制品进行鉴别实验,主要采用免疫学检测方法（免疫斑点或免疫印迹）。此方法周期长,成本高,抗体间有批次的差异且全过程需要低温运输与保存,不利于快速检测。本课题筛选出的纳米抗体,采用原核表达体系进行生产,降低了生产成本,全过程无需冷链运输,且开发出了胶体金试纸条,实现了快速检测。研究方法1、通过免疫动物羊驼,检测免疫效价达到建库要求,收集血清中的淋巴细胞,得到cDNA文库,采用通用引物进行扩增、酶切、连接、电转化,建立噬菌体文库。2、针对重组人干扰素α2b进行多轮富集和筛选,得到一株靶向重组人干扰素α2b的纳米抗体,将其命名为I₂₂,进行了ELISA和Western Blot验证。3、构建了pET28a-His-I₂₂-His,pET28a-His-I₂₂,pET28a-I₂₂-His三株原核表达质粒载体,对其进行表达和纯化。4、进行部分理化性质方面的研究如全柱成像毛细管等电点的检测,N端测序,质谱分子量的测定,同时采用药典的方法将纳米抗体I₂₂、商品化的单克隆抗体、多克隆抗体分别与重组人干扰素α2b标准品进行抗体中和实验,验证它们对重组人干扰素α2b制品生物活性的影响。5、将纳米抗体I₂₂放置在室温下保存,对其进行免疫鉴别试验,并且与商品化的单克隆抗体进行灵敏度检测比较。建立半定量检测重组人干扰素α2b的含量的方法,并且将纳米抗体I₂₂与胶体金标记,开发胶体金试纸条进行快速检测。研究结果1、获得库容量为2.6×10⁸的抗重组人干扰素α2b纳米抗体的基因文库,经过噬菌体救援得到抗重组人干扰素α2b纳米抗体噬菌体展示文库,测滴度为3.1×10¹³CFU/mL。2、对筛选的阳性克隆,分别进行ELISA和Western Blot实验对其进行验证,经ELISA验证总共得到2个阳性克隆,将阳性克隆进行测序,分析结果经对比得到相同的序列,将它命名为纳米抗体I₂₂。Western Blot验证阳性克隆的上清与重组人干扰素α2b进行特异性结合。3、将三株构建的菌株pET28a-His-I₂₂-His,pET28a-His-I₂₂,pET28a-I₂₂-His都进行了诱导表达,得到了分子量大致相等的蛋白,且都能与重组人干扰素α2b进行结合,没有明显的差异。在理化性质检测与应用实验中都采用pET28a-His-I22-His表达的目的蛋白进行研究,目的蛋白的产量约为45.7mg/L,纯度为100%。4、经全柱成像毛细管测得纳米抗体的等电点约8.20。N端测序测得氨基酸序列与理论结果一致。质谱测得纳米抗体I₂₂分子量为14226.80Da,与理论分子量14226.77Da一致。证明纳米抗体I₂₂与商品化的单克隆抗体对重组人干扰素α2b制品的生物活性没有影响,多克隆抗体对重组人干扰素α2b制品生物活性有影响。5、纳米抗体I₂₂应用于Western Blot实验中,且对重组人干扰素α2b制品有特异性,对重组人干扰素α2b制品中的辅料人血白蛋白没有结合作用。将纳米抗体I₂₂与商品化的单克隆抗体（抗重组人干扰素α2b）进行比较分析,证明纳米抗体的检测限约为31.25ng,同等实验条件下商品化的单克隆抗体的检测限约为125ng。纳米抗体I₂₂应用于半定量检测重组人干扰素α2b的含量,精确度高,实验结果准确。纳米抗体I₂₂与胶体金标记技术相结合,检测重组人干扰素α2b的检测限可达到1μg/mL。结论本文首次得到了抗重组人干扰素α2b纳米抗体的基因序列,构建到原核表达体系大肠杆菌中得到了可溶性表达,对表达的目的蛋白进行Western Blot验证,证明纳米抗体I₂₂比商品化的单克隆抗体更灵敏,且不受温度的影响,商品化的抗体产量约为25mg/L,纳米抗体的产量约为45.7mg/L,经镍柱纯化得到纯度100%,降低了生产成本。开发的胶体金试纸条可以实现快速检测,将原本耗时两天的免疫鉴别试验缩短为几分钟完成的快速检测,实现了快速检测的初步应用。