研究背景和目的皮肤作为人体最大的器官,约占人体体重的8%,具备屏障、感觉、吸收、体温调节等多种生理功能,是机体防御外来侵袭的第一道防线,也是最容易出现损伤的部位。由于外伤、炎症、溃疡、烧伤、肿瘤术后等原因造成的皮肤软组织缺损,一直是整形外科所面临的难题以及挑战。皮肤软组织缺损的修复,临床上主要采用皮片移植和皮瓣移植。皮片移植术后颜色质地较差、易挛缩等只能起到覆盖创面的效果。对于颜面、功能部位以及骨、神经、血管暴露和慢性溃疡等创面,必需采用皮瓣移植才能达到兼顾外形和功能的修复,但皮瓣移植存在供区受限、继发创伤和畸形等诸多缺陷,也极大限制了其应用。而对于大面积的皮肤软组织缺损,自体皮源不足的情况下,不管是皮片还是皮瓣移植,均无法解决问题。因此,目前关于皮肤创面修复的研究主要集中于以下三方面：1、如何实现创面更快的愈合同时减少术后瘢痕的形成；2、明确皮肤再生的主要机制；3、发展具备正常皮肤生理结构及功能的组织工程化皮肤；自1988年开始,组织工程被正式定义,即联合运用生物工程以及生命科学的原理和方法,探索正常以及病理组织的结构和功能间存在的联系,研制生物组织替代物,用于恢复、维持甚至促进其原有的组织功能。不过早在1975年Rheimvald首次实现在体外条件下分离培养表皮细胞,皮肤替代物的研究就已经逐渐展开。组织工程化皮肤的不断发展,为皮肤软组织缺损的修复提供了新的治疗策略,主要分为以下3种类型：表皮替代物、真皮替代物和复合皮肤替代物,而包含脂肪层的皮肤复合组织将可能成为第4种类型。目前已经临床报道将商品化的表皮替代物、真皮替代物以及双层的表皮-真皮复合组织替代物应用于治疗多种创伤。市场上比较常见的商品化皮肤替代物有Epicel、Alloderm、Integra、Dermagraft、Apligraft等。其中,Intregra是人工合成真皮替代物,在1996年被美国FDA批准用于治疗烧伤,在临床应用中取得了良好的效果,不仅操作方便且愈后较美观。Apligraf是在1998年被美国FDA批准治疗静脉淤滞性溃疡的,它是以Ⅰ型牛胶原基质为支架,复合成纤维细胞和表皮细胞,形成的第一个含活细胞真正意义上的组织工程复合皮肤。Apligraf已成功应用于治疗静脉淤滞性溃疡和糖尿病足部溃疡,促进创面愈合。总之,商品化得皮肤替代物的出现为创面修复提供了新的可能。另外,长期临床观察发现皮肤替代物也存在应用的局限性。表皮替代物移植存在耗时长、接受率低、菲薄易碎、易挛缩、抗感染能力差等缺点,其修复效果难以令人满意。真皮替代物虽对创面要求不高,且发生挛缩程度降低,但由于缺少表皮的防护,使感染机率升高,容易造成感染和体内水电解质代谢紊乱,且术后外观欠佳,尤其是暴露部位,往往需二次进行刃厚皮片移植覆盖。表皮-真皮复合皮替代物在生理结构方面类似于人正常皮肤,且被证实了能够在表皮层与真皮层形成基底膜成分沉积,具有良好机械物理支撑和移植物接受率,改良了单纯表皮替代物、真皮替代物等存在的大部分缺陷,是目前较成熟的双层复合皮肤替代物,具备永久性修复创面的效果。然而,即便是双层结构的复合皮肤替代物,也是相对比较薄,对于一些特殊的创面,比如严重深度烧伤、肿瘤切除后、长期慢性溃疡导致的伴随着软组织缺损的创面,仍存在运用的局限性,目前除了皮瓣移植没有更好的选择。其主要原因是皮瓣有别于皮片,具备良好血供的同时还含有皮下脂肪层。皮下脂肪层一方面能够填充皮下软组织缺损,另一方面还使皮肤具备局部抗外力打击、温度调节、能量储存等生理功能。因此,构建含皮下脂肪层的皮肤替代物是可能是未来解决这种难题的可行性措施。然而构建含皮下脂肪层的三层结构复合皮肤替代物,首先必须面临的问题,怎么构建出皮下脂肪层?这是成功构建含脂肪层复合皮肤替代物的前期基础,也是本研究的目的所在。关于如何选择支架是构建组织工程的基本问题。脱细胞小肠粘膜下层基质(small intestinal submucosa, SIS)的主要成分是I型(>90%)以及Ⅲ型的胶原,与正常皮肤的真皮成分相接近。目前SIS已经成功应用在超过4000名病人身上,治疗多种创伤,包括烧伤、慢性不愈合溃疡、糖尿病溃疡、尿失禁等多种疾病。而且研究证实,应用SIS能够显著性促进创面的愈合程度以及最终的愈合率,特别是用于难治性的溃疡和创面的治疗。SIS能够通过释放多种细胞因子抑制基质金属蛋白酶活性,同时诱导新生血管的形成；作为天然的细胞外基质成分,SIS被证实能够促进多种细胞的粘附、增值以及分化。目前已有研究利用SIS构建的双层皮肤复合组织用于创面修复,该研究也证实SIS能够促进表皮细胞和成纤维的粘附、增殖以及分化,并伴随着表皮和真皮间基底膜成分的沉积,进一步证实了SIS是一种理想的组织工程化皮肤的载体支架。脂肪干细胞(adipose-derived stem cells, ASCs)作为脂肪组织的前体细胞,是一种理想的种子细胞材料,能够与多种生物支架结合(包括胎盘去细胞基质、聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA、透明质酸、胶原海绵、纤维蛋白等)用于构建组织工程化脂肪。我们前期研究已经成功在体外条件下,复合脂肪干细胞以及牛胶原凝胶支架构建出组织工程化脂肪,但在此过程中我们发现,胶原凝胶所构建的组织工程化脂肪存在降解速度快、培养过程收缩明显等不足。降解速度的快慢直接影响到组织再生修复的效果,宿主在8-12W内完成支架降解有利于组织再生修复,过早的降解则会导致细胞失去物理支撑结构。SIS支架作为细胞载体支架则不存在以上问题。而且研究表明SIS能够促进ASCs分泌多种细胞因子,如血管生长因子VEGF(vascular endothelial growth factor),从而导致其血管化以及促进组织再生能力明显优于其他生物支架,包括脱细胞真皮基质以及胶原-硫酸软骨素-透明质酸支架。因此,在本研究中选择S1S作为细胞载体支架,进行构建组织工程化脂肪的相关研究。另外,移植后的ASCs的分化及最终转归也是一个需要考虑的问题。研究表明,单纯的ASCs悬浮液注射后带来的往往不是成脂化,而是纤维化。因此,日本学者Yousimura认为ASCs的应用应该与生物支架材料相结合,以避免往不必要的方向分化。而为了使移植后的ASCs更多地往脂肪组织的方向分化,前体是必须提供一个良好的成脂环境。因此,在本研究中采用经体外成脂诱导后再移植体内的方法,一方面能够ASCs提前适应支架生存环境,另一方面也使支架有利于宿主来源干细胞往脂肪细胞方向分化。基于以上的研究,在本研究中我们提出以下假设：复合脂肪干细胞(ASCs)和脱细胞小肠粘膜下层基质(SIS)形成的含活性细胞的支架复合物,经体外成脂诱导后能够形成较好的成脂环境,移植体内后接近于正常生理结构的成脂微环境,适合移植的ASCs以及趋化而来的干细胞往成脂化方向发展,最终实现组织工程化脂肪的构建。因此在本研究中我们首先将不同制备方法获得的SIS进行生物相容性以及免疫原性进行评估,并将优选方案获得的SIS作为ASCs的载体支架,通过合理的培养方式形成含活性细胞的支架复合物,在进一步研究分析其体内外成脂情况。这对于深入了解ASCs与SIS生物支架结合后的存活以及最终转归情况、支架移植后形成的新生物细胞来源分析有重要意义,同时也为探索构建含皮下脂肪层的组织工程化皮肤做前期铺垫。方法1、不同制备方法获得的SIS进行生物相容性以及免疫原性对比采用三种不同的制备方法制备脱细胞小肠粘膜下层基质,并将新鲜猪小肠分别采用单纯机械法、机械-化学法、机械-酶消化法制备三种不同的SIS,分别作为A、B、C组;通过复合成纤维细胞构建真皮替代物,利用HE染色观察支架组织学形态以及细胞粘附情况、MTT法检测细胞增殖情况,同时观察支架移植SD大鼠皮下1、2、4周后炎症反应及血管化程度。从而综合判断哪种制备方案获得的SIS是更好的细胞载体支架。2、复合脂肪干细胞和脱细胞小肠粘膜下层基质的成脂情况评估采用优选方案法制备脱细胞小肠粘膜下层基质,并进行HE染色以及扫描电镜观察观察组织学形态,然后将其移植大鼠体内1、2、4W分三个时间点取材观察其宿主炎症反应及血管化程度；将分离获取的脂肪细胞进行流式细胞鉴定,并采用MTT法检测细胞在支架上的增殖活性；将细胞-支架复合物体经体外培养1W后再成脂诱导2W后进行油红O染色；另外,将体外成脂诱导1W的复合物移植到SD大鼠皮下,5W后取材,通过组织学HE、围脂滴蛋白染色观察、以及成脂基因PCR检测评价复合物成脂情况,从而判断复合脂肪干细胞和脱细胞小肠粘膜下层基质成脂的潜能。3、统计学处理采用SPSS13.0统计软件包进行分析。数据以均数±标准差表示,三组间比较采用方差分析,组内两两比较采用q检验；单独两组的采用独立t检验,P<0.05为有统计学意义结果1、组织学观察A组有细胞残留,B、C组未见细胞残留。MTT结果显示细胞在支架上生长旺盛增殖能力强,其中A组优于B、C组；皮下移植后的HE结果表明B组引起炎症反应较A、 C组弱,而C组血管化程度较A、 B组更明显。2、HE及扫描电镜结果显示制备所得的脱细胞小肠粘膜下层基质无细胞残留,其主要成分是胶原纤维；SIS移植大鼠体内后炎症反应较阳性对照组明显减弱,第2W开始有新生血管出现,第4W的血管化更加明显；脂肪干细胞流式结果显示CD73、CD90、CD 105阳性,而CD31、CD34、CD45阴性。MTT结果显示脂肪干细胞在SIS支架上培养的增殖活性优于单纯细胞培养。体内外实验结果显示,脂肪干细胞能够在脱细胞小肠粘膜下层基质上分化为脂肪细胞,而且体内对比研究发现,细胞-支架复合物最终成脂情况明显优于单纯支架。讨论皮肤软组织大面积缺损是目前临床不得不面临的难题,常规的应对方法,包括皮片转移、皮瓣转移等,均存在应用的局限性,而组织工程化皮肤的发展及推广应用,为其提供了新的治疗策略。组织工程化皮肤基本围绕着“种子细胞、细胞支架、生长需要的多种细胞因子”这三个元素进行构建。其中作为支架支撑结构的细胞外基质,能够促进多种细胞的增值、粘附、分化,为多种组织的再生提供基本的组织架构。其主要的机制与细胞外基质支架的制备方法、降解速率、表面结构、生长因子的释放等密切相关。由于采用不同的制备方法,最终得到的生物支架材料的物理以及生物学属性均有所差别。细胞外基质支架制备需要多个步骤进行,每个步骤均能够明显影响生物支架的结构成分以及移植后引起的宿主排斥反应。单纯的物理方法并不能达到完全去除细胞的效果,因此,最常用的脱细胞方法是联合物理法和化学法,在脱细胞的过程让支架上的细胞充分接触洗涤剂以及蛋白酶、化学试剂等,脱细胞的同时保持支架的天然成分、机械完整性,并尽量减少对生物活性产生的不利影响。目前SIS的处理主要采用物理法和化学法相结合的技术。物理法主要为机械刮除法,能够去除SIS组织大部分细胞成分。化学法主要是通过单独或联合应用化学试剂,如酶、碱、酸、有机试剂等物质,去除SIS表面残留的细胞和细胞碎片,达到脱细胞目的。Badylak等通过简单的机械方法去除粘膜下层以外的成分然后进行过氧乙酸消毒后得到SIS,其胶原结构完整且连续性好,但细胞残余成分较多。Abraham等应用机械-化学法制备的SIS胶原结构相对较完整、胶原纤维未见明显膨隆,在清除细胞成分的同时几乎未破坏SIS的生物学活性,保留了良好的力学强度。陈薇等采用机械-酶处理法制备SIS,用Nest-PCR技术和ELISA法检测细胞残留量和生长因子含量,结果显示该制备方法能有效去除组织残留细胞,显著降低死亡相关蛋白DAP12含量,而且生长因子含量无明显改变。而本研究通过对比以上三种不同方法制备的SIS的生物相容性以及免疫原性后发现,单纯机械法制备的SIS更有利于Fb的粘附、增殖；而机械-化学法制备的SIS则免疫原性较低,移植皮下后产生炎症反应较弱；机械-酶消化法制备的SIS支架移植后的血管化程度较其它两者明显。因此本研究认为,机械-化学法以及机械-酶消化法制备的SIS具有良好的生物相容性以及免疫原性,可作为构建组织工程化皮肤细胞载体的选择。在获得制备SIS优选方案的基础上,我们进一步研究复合脂肪干细胞(ASCs)以及脱细胞小肠粘膜下层基质(SIS)成脂化的情况。体外研究证实,SIS有利于ASCs的粘附、增殖、浸润以及最终分化为含脂滴的成熟脂肪细胞。而且,通过单纯支架体内移植的结果显示,SIS经完整脱细胞后引起的炎症化程度明显低于阳性对照组,而且移植后的2W开始出现新生毛细血管,4W血管化更加明显,并随着时间的延长逐渐与周围组织相融合,与相关文献报道基本符合[22],而且该研究表明,随着ASCs种植与SIS支架上,其血管化速度将进一步增强考虑与支架本身含有多种促血管生长因子(如VEGF、FGF-2)以及SIS对ASCs旁分泌的促进作用密切相关。基于以上发现,本研究中将移植后第5W作为后期体内成脂化得观察时间点。组织学观察表明,在体外条件下,种植于SIS支架上ASCs经成脂诱导分化为含脂滴的成熟脂肪细胞,证实SIS支架适宜ASCs的分化。进一步体内研究发现,ASCs-SIS细胞支架复合物经体外成脂诱导后移植体内能够往成脂化的方向发展。对比于单纯空白支架组,复合ASCs-SIS组的移植物包含更多地脂肪组织。而且通过PCR对比成脂化基因PPARγ2、LPL、FABP4的结果显示,ASCs-SIS组的移植物其成脂化能力也明显优于单纯空白支架组,与组织学观察结果相一致。对于产生以上结果的分析,本研究认为可能是基于两点,首先,SIS支架能够提供机械物理支撑的同时,还能引起低水平的炎症反应,使炎症细胞以及干细胞趋化到该部位,参与组织的再生。其次,成脂诱导后的ASC粘附于支架上,会对SIS支架的成分以及结构产生影响,使成脂诱导后的ASC-SIS细胞支架复合物所形成的微环境更有利于趋化而来的具有多能属性的干细胞,包括间充质干细胞、炎症细胞、脂肪前体细胞等往成脂方向分化,实现脂肪组织的再生。成脂诱导后的ASCs-SIS细胞支架复合物所形成的成脂微环境与宿主来源的细胞群体间的“动态相互作用”是组织再生中的关键因素。另外,最近研究已经证实,体外条件下的成熟脂肪细胞也能够促进ASCs增殖以及分化。因此,不管是成脂诱导后的ASCs或者移植后ASCs分化而成的成熟脂肪细胞,甚至是周围脂肪组织中的脂肪细胞,均是影响趋化而来的干细胞往成脂分化的重要因素。另外,细胞标记追踪结果显示,移植物来源的ASCs最终分化为脂肪细胞,但其数量相对较少,间接证实了新生脂肪组织中的脂肪细胞多源于宿主来源干细胞的分化；因此,本研究认为即便ASCs具备多能属性,可以分化为脂肪细胞,通过直接替代作用参与组织再生,但近年来越来越多的研究[26-27]更倾向于认为ASCs的治疗作用主要是通过发挥旁分泌和免疫调节功能,调控组织周围相关细胞以及改善微环境等作用参与修复和重建,而不是直接替代作用。而至于在成脂化过程中发挥主要作用的宿主来源干细胞是血源性的还是周围组织来源,以及宿主来源的干细胞是否在成脂化过程中发挥其他作用,仍需进一步的研究探索。综上所述,本研究所采用的构建方法,复合脂肪干细胞和脱细胞小肠粘膜下层基质所形成的细胞支架复合物,经体外成脂诱导后,移植体内后能够形成良好的成脂微环境,促进移植物和宿主来源的干细胞最终分化为脂肪细胞,从而构建出组织工程化脂肪,为组织容量缺失的修复提供了新的治疗思路,为后续的构建含皮下脂肪层的组织工程化皮肤做了前期铺垫。结论1、机械-化学法以及机械-酶消化法制备的SIS具有良好的生物相容性以及免疫原性,适宜细胞的生长以及移植后宿主炎症反应较弱,可作为构建组织工程化皮肤细胞载体的选择。2、复合脂肪干细胞以及脱细胞小肠粘膜下层形成的构建物,经体外成脂诱导后能够形成合适的成脂微环境,移植后接近于体内正常的成脂微环境,使移植物以及宿主来源的干细胞往脂肪细胞方向分化,最终现实组织工程化脂肪的构建,为组织容量缺失的修复提供了新的治疗思路,同时为后续的构建含皮下脂肪层的组织工程化皮肤做了前期铺垫。