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钙网蛋白（CRT）是主要定位于内质网的保守蛋白，细胞生物学功能广泛，在病理状况下也会被释放到细胞外空间。已有的证据表明，CRT在许多肿瘤组织以及肿瘤患者的体液中高表达，既在肿瘤生成过程中发挥作用，又在抑制血管生成、参与肿瘤免疫监视与清除的过程中扮演着重要角色。因此本实验室前期工作利用小鼠黑色素瘤(B16)系统研究了可溶性 CRT对肿瘤体内外生长的影响，结果显示可持续分泌可溶性CRT的B16细胞(B16-CRT)体外的增殖、迁移以及粘附能力与其对照细胞（B16-EGFP）无显著差异，但其体内成瘤性要明显强于对照细胞，并且诱导一群髓系来源的抑制性细胞(Myeloid-derived Suppressor Cells，MDSCs)在脾脏、血液以及肿瘤组织中富集。进一步利用裸鼠以及MDSCs缺失小鼠的成瘤模型证明MDSCs在B16-CRT荷瘤小鼠体内富集是B16-CRT具有强成瘤性的关键因素。因此本课题主要探讨肿瘤微环境来源的CRT富集MDSC的可能分子机制。 本研究首先区分了在 B16-CRT荷瘤小鼠外周富集的MDSCs细胞亚群为G-MDSC(CD11b+Ly6G+Ly6Clow)，而对 M-MDSC(CD11b+Ly6G-Ly6Chigh)无显著影响，因此本课题主要围绕 CRT对 G-MDSC分化及功能的影响进行探讨。MDSCs在体内的分布和富集主要由机体通过以下三个环节进行调控：骨髓细胞向MDSCs方向的分化和增殖；外周MDSCs的存活；MDSCs向其他髓系终末端细胞亚群的分化，包括巨噬细胞，树突状细胞等。本研究从体内、外两个层面对CRT诱导MDSCs的三方面富集机制进行探讨。首先利用BrdU体内掺入的方法比较了B16-CRT与B16-EGFP荷瘤小鼠骨髓中各MDSCs亚群的增殖能力，结果显示 B16-CRT荷瘤小鼠骨髓中的 G-MDSC增殖速度显著高于 B16-EGFP荷瘤小鼠，并且体外利用CRT直接作用于小鼠骨髓细胞，也可促进G-MDSC的增殖。在此基础上，进一步利用过继转移模型验证了骨髓细胞在已建立的B16-CRT荷瘤小鼠体内向G-MDSC的分化速度也远远强于其在B16-EGFP荷瘤小鼠体内的分化速度。B16-CRT以及B16-EGFP荷瘤小鼠脾脏以及外周血中的MDSCs的存活率并无显著差别，但体外CRT可抑制MDSCs的凋亡，提示CRT促进MDSCs的存活可能是其导致MDSCs在荷瘤小鼠体内富集的因素之一。对荷瘤小鼠的脾脏以及外周血中的各髓系细胞比例分析发现，B16-CRT荷瘤小鼠脾脏以及外周血中的 DC细胞比例显著低于对照小鼠，提示CRT可能抑制了MDSCs向DC的分化，进一步利用体外实验验证了CRT本身具有抑制MDSCs向DC分化的能力。此外本实验室前期研究中还发现在肿瘤局部组织MDSCs细胞在B16-CRT荷瘤小鼠中也显著富集，本课题利用体外Transwell系统证明了CRT本身可促进MDSCs细胞的迁移。以上结果证明 CRT可通过促进骨髓中 MDSCs的增殖，促进外周组织中 MDSCs的存活，以及抑制MDSCs向DC的分化诱导荷瘤小鼠体内MDSCs细胞的富集，并通过肿瘤组织中的CRT趋化MDSCs向肿瘤组织中进一步富集，从而促进肿瘤细胞在体内的成瘤。在此基础上，本课题对CRT诱导荷瘤小鼠MDSCs富集的分子机制进行了进一步探索。由于TLR4是可溶性CRT的重要受体之一，且表达于MDSCs表面并发挥重要作用，我们首先考察了B16-CRT体内的强成瘤性在TLR4-/-小鼠体内是否存在。结果显示，B16-CRT在TLR4-/-小鼠体内成瘤性与B16-EGFP无显著性差异，并且对MDSCs细胞的富集作用也可被显著逆转，提示TLR4可能是介导肿瘤来源CRT富集MDSCs的主要受体。进一步利用来源于TLR4-/-荷瘤小鼠的MDSCs验证了CRT促进骨髓中MDSCs的增殖，抑制MDSCs向DC的分化以及诱导MDSCs细胞的迁移均依赖于TLR4受体。据文献报道，S100A8/9是髓系细胞分泌的一类重要的细胞因子，其对MDSCs细胞的增殖、分化及迁移均有直接的影响。本课题的研究结果显示CRT可诱导MDSCs细胞表达S100A8/9，且这种刺激作用依赖于TLR4，进一步利用封闭抗体阻断S100A8/9后可抑制CRT对MDSCs的分化以及迁移的影响。综上所述，本课题提出了肿瘤微环境来源的CRT通过TLR4-S100A8/9这一轴线来诱导MDSCs细胞在荷瘤小鼠体内富集，从而促进肿瘤发生发展的新机制，为CRT在肿瘤发生发展中的作用提出一个新的立足点，也为肿瘤的免疫治疗提供了一定的理论基础。