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疼痛是一种复杂的体验,不仅涉及有害环境刺激的转导,还涉及大脑的认知和情感处理。臂旁核(Parabrachial nullei,PBN)位于脑桥上部,参与大脑的疼痛调节,将来自外周的伤害性信息传递到与疼痛有关的大脑区域。研究表明,降钙素基因相关肽(Calcitonin gene-related peptide,CGRP)及其受体广泛的分布于机体的各种组织和细胞,在中枢和外周神经系统的伤害性信息传递中起着重要作用,并且免疫组化和原位杂交显示,PBN内有CGRP神经元及CGRP阳性纤维和CGRP受体的分布。近来研究显示,PBN内的CGRP神经元能传输到其他脑区,参与疼痛的调节。
目的:明确CGRP在大鼠PBN内的痛觉调节作用及其机制。
方法:利用立体定位仪,在正常大鼠的脑内埋管,微量注射不同剂量的CGRP到PBN内,用热板实验和压板实验检测大鼠对伤害性热刺激和机械刺激的后爪缩爪反应潜伏期(Hindpaw withhdawal latency,HWL),观察CGRP在正常大鼠PBN内的痛觉调节作用。在明确CGRP在正常大鼠PBN内的痛觉调节作用后,在正常大鼠PBN内注射CGRP受体拮抗剂CGRP8-37,观察CGRP8-37对CGRP在大鼠PBN内所诱导的疼痛调节作用的影响。在正常大鼠PBN内微量注射慢病毒包裹的CGRP受体siRNA,敲减CGRP受体,用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)检测CGRP受体mRNA的表达水平并用免疫印迹法(Western blot)检测CGRP受体蛋白含量的变化,并通过痛觉行为学测试检测CGRP受体敲减后大鼠的HWL的变化。
采用慢性坐骨神经轻度结扎(Chronic constriction injury,CCI)法制作神经性痛模型,同样在PBN内微量注射不同剂量的CGRP,通过痛觉行为学测试观察大鼠的HWL,从而明确CGRP在神经性痛大鼠PBN内所发挥的疼痛调节作用,注射CGRP8-37,观察CGRP受体对CGRP在神经性痛大鼠PBN内疼痛调节作用的影响。随后采用RT-PCR和Western blot技术检测正常大鼠和神经性痛大鼠PBN内降钙素受体样受体(Calcitonin receptor-like peptide,CLR)在mRNA和蛋白水平的表达,并用Western blot检测两种大鼠PBN内细胞膜上CLR蛋白的含量。
在大鼠左足足跖注射角叉菜胶,建立炎症性痛模型,按照上述方法在炎症性痛大鼠PBN内注射不同剂量的CGRP和一定剂量的CGRP8-37,通过热板实验和压板实验观察炎症性痛大鼠的HWL,明确CGRP及CGRP8-37在炎症性痛大鼠PBN内疼痛调节作用。用RT-PCR检测正常大鼠和炎症性痛大鼠PBN内CGRP受体在mRNA的表达水平并用Western blot检测CGRP受体蛋白含量的变化。
结果:热板实验和压板实验显示,在正常大鼠PBN内注射不同剂量的CGRP后,大鼠伤害性热刺激和机械刺激的HWL均显著升高,提示CGRP在正常大鼠PBN内有镇痛作用并且呈剂量依赖性。在正常大鼠PBN内注射CGRP受体拮抗剂后发现,与注射CGRP相比,注射CGRP8-37后伤害性热刺激和机械刺激的HWL显著降低,说明CGRP8-37降低了CGRP在正常大鼠PBN内诱导的镇痛作用,提示CGRP受体介导了CGRP在正常大鼠PBN内的疼痛调节作用。敲减CGRP受体后,RT-PCR和Western blot显示,CGRP受体在mRNA和蛋白水平的表达均下降,行为学测试显示大鼠PBN内的CGRP受体被敲减后,大鼠伤害性热刺激和机械刺激的HWL均显著下降,CGRP在正常大鼠PBN内诱导的镇痛作用显著降低。在神经性痛大鼠和炎症性痛大鼠中同样发现,CGRP在PBN内有镇痛作用并且呈剂量依赖性,并且CGRP8-37降低了CGRP受体在大鼠PBN内诱导的镇痛作用,提示CGRP受体介导了CGRP在神经性痛大鼠和炎症性痛大鼠PBN内的疼痛调节作用。将CGRP在正常大鼠PBN内诱导的镇痛效果与在神经性痛和炎症性痛大鼠PBN内诱导的镇痛作用效果做了比较,发现,在两种疼痛模型大鼠PBN内,CGRP诱导的镇痛作用显著低于正常大鼠。为明确这一现象是否是由于CGRP受体的作用,运用分子生物学技术检测了CGRP受体。RT-PCR反应结果显示,与正常大鼠相比,神经性痛大鼠PBN内CGRP受体在mRNA水平的表达下降,Western blot结果显示,神经性痛大鼠PBN内CGRP受体在蛋白水平表达下降,并且在细胞膜水平上,CGRP受体含量降低。同样,与正常大鼠相比,在炎症性痛大鼠PBN内CGRP受体的表达显著下降。以上实验结果表明,CGRP受体参与了CGRP诱导的镇痛作用,并且神经性痛与炎症性痛还会导致CGRP受体表达下降,CGRP诱导的镇痛作用明显降低。
结论:CGRP参与正常、神经性痛和炎症性痛大鼠PBN内的痛觉调节,CGRP受体的表达能够影响CGRP在PBN内的镇痛作用。
创新点:发现了CGRP在正常、神经性痛、炎症性痛大鼠PBN内具有镇痛作用,且CGRP受体介导这一作用,以上实验结果对CGRP参与的中枢镇痛提供了新见解。
目的:明确CGRP在大鼠PBN内的痛觉调节作用及其机制。
方法:利用立体定位仪,在正常大鼠的脑内埋管,微量注射不同剂量的CGRP到PBN内,用热板实验和压板实验检测大鼠对伤害性热刺激和机械刺激的后爪缩爪反应潜伏期(Hindpaw withhdawal latency,HWL),观察CGRP在正常大鼠PBN内的痛觉调节作用。在明确CGRP在正常大鼠PBN内的痛觉调节作用后,在正常大鼠PBN内注射CGRP受体拮抗剂CGRP8-37,观察CGRP8-37对CGRP在大鼠PBN内所诱导的疼痛调节作用的影响。在正常大鼠PBN内微量注射慢病毒包裹的CGRP受体siRNA,敲减CGRP受体,用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)检测CGRP受体mRNA的表达水平并用免疫印迹法(Western blot)检测CGRP受体蛋白含量的变化,并通过痛觉行为学测试检测CGRP受体敲减后大鼠的HWL的变化。
采用慢性坐骨神经轻度结扎(Chronic constriction injury,CCI)法制作神经性痛模型,同样在PBN内微量注射不同剂量的CGRP,通过痛觉行为学测试观察大鼠的HWL,从而明确CGRP在神经性痛大鼠PBN内所发挥的疼痛调节作用,注射CGRP8-37,观察CGRP受体对CGRP在神经性痛大鼠PBN内疼痛调节作用的影响。随后采用RT-PCR和Western blot技术检测正常大鼠和神经性痛大鼠PBN内降钙素受体样受体(Calcitonin receptor-like peptide,CLR)在mRNA和蛋白水平的表达,并用Western blot检测两种大鼠PBN内细胞膜上CLR蛋白的含量。
在大鼠左足足跖注射角叉菜胶,建立炎症性痛模型,按照上述方法在炎症性痛大鼠PBN内注射不同剂量的CGRP和一定剂量的CGRP8-37,通过热板实验和压板实验观察炎症性痛大鼠的HWL,明确CGRP及CGRP8-37在炎症性痛大鼠PBN内疼痛调节作用。用RT-PCR检测正常大鼠和炎症性痛大鼠PBN内CGRP受体在mRNA的表达水平并用Western blot检测CGRP受体蛋白含量的变化。
结果:热板实验和压板实验显示,在正常大鼠PBN内注射不同剂量的CGRP后,大鼠伤害性热刺激和机械刺激的HWL均显著升高,提示CGRP在正常大鼠PBN内有镇痛作用并且呈剂量依赖性。在正常大鼠PBN内注射CGRP受体拮抗剂后发现,与注射CGRP相比,注射CGRP8-37后伤害性热刺激和机械刺激的HWL显著降低,说明CGRP8-37降低了CGRP在正常大鼠PBN内诱导的镇痛作用,提示CGRP受体介导了CGRP在正常大鼠PBN内的疼痛调节作用。敲减CGRP受体后,RT-PCR和Western blot显示,CGRP受体在mRNA和蛋白水平的表达均下降,行为学测试显示大鼠PBN内的CGRP受体被敲减后,大鼠伤害性热刺激和机械刺激的HWL均显著下降,CGRP在正常大鼠PBN内诱导的镇痛作用显著降低。在神经性痛大鼠和炎症性痛大鼠中同样发现,CGRP在PBN内有镇痛作用并且呈剂量依赖性,并且CGRP8-37降低了CGRP受体在大鼠PBN内诱导的镇痛作用,提示CGRP受体介导了CGRP在神经性痛大鼠和炎症性痛大鼠PBN内的疼痛调节作用。将CGRP在正常大鼠PBN内诱导的镇痛效果与在神经性痛和炎症性痛大鼠PBN内诱导的镇痛作用效果做了比较,发现,在两种疼痛模型大鼠PBN内,CGRP诱导的镇痛作用显著低于正常大鼠。为明确这一现象是否是由于CGRP受体的作用,运用分子生物学技术检测了CGRP受体。RT-PCR反应结果显示,与正常大鼠相比,神经性痛大鼠PBN内CGRP受体在mRNA水平的表达下降,Western blot结果显示,神经性痛大鼠PBN内CGRP受体在蛋白水平表达下降,并且在细胞膜水平上,CGRP受体含量降低。同样,与正常大鼠相比,在炎症性痛大鼠PBN内CGRP受体的表达显著下降。以上实验结果表明,CGRP受体参与了CGRP诱导的镇痛作用,并且神经性痛与炎症性痛还会导致CGRP受体表达下降,CGRP诱导的镇痛作用明显降低。
结论:CGRP参与正常、神经性痛和炎症性痛大鼠PBN内的痛觉调节,CGRP受体的表达能够影响CGRP在PBN内的镇痛作用。
创新点:发现了CGRP在正常、神经性痛、炎症性痛大鼠PBN内具有镇痛作用,且CGRP受体介导这一作用,以上实验结果对CGRP参与的中枢镇痛提供了新见解。