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人参(Panax ginseng C.A.Meyer)是我国传统名贵中药材,有“百草之王”的美誉,其包含的大量活性成分在中医学和西医学中均有重要地位。普通人参的成熟果实为红色,而韩国金丰人参和中国黄果人参的成熟果实均为黄色。其中黄果人参是由中国农业科学院特产研究所选育的人参栽培新品种,具有人参皂苷等活性成分含量高的特点,为我国人参的栽培和育种增添了新的宝贵种质资源。随着人参种植及生产业的不断发展,人参栽培品种混乱、种性退化等问题日益明显,严重影响了人参的质量及其种质纯度。品种鉴定是质量控制的关键,开发简便、准确的人参品种鉴定方法,对人参产品质量的控制及优质人参品种的选育均具有重要意义。相比于传统的鉴定方法,DNA分子标记是从分子水平上直接分析不同物种的遗传物质,能有效排除因生长环境和发育阶段的不同对鉴定结果的干扰,具有多态性高、鉴定准确、重复性高等优点,为人参的品种鉴定及优质品种的选育提供了一种有效的技术手段。
本论文基于前期研究在人参叶绿体的短单拷贝区(SSC)的蛋白质编码基因ccsA和长单拷贝区(LSC)的rpoC2基因中发现的黄果人参品种的两个单核苷酸多态性(SNP)位点,进行了生物信息学分析,并设计了黄果人参和红果人参的两对特异性引物,利用荧光定量及多重PCR体系构建了人参优质栽培品种黄果的SNP分子鉴定方法。此外,利用ccsA和26S rDNA基因对中国黄果人参和韩国金丰人参进行鉴定,发现了金丰人参的SNP分子标记,为实现金丰人参的鉴别,基于该位点设计了特异性引物,构建多重PCR体系,开发了可以鉴别中国黄果人参和韩国金丰人参的分子技术。主要结果如下:
1.根据前期研究中发现的黄果人参的SNP位点进行生物信息学分析发现,黄果人参在ccsA基因的第635个碱基处和rpoC2基因中的第685个碱基处均发生了非同义替换,导致其氨基酸分别从谷氨酰胺(Q)变为精氨酸(R)、甘氨酸(G)转为丝氨酸(S),进而致使其蛋白质的二级结构和三维结构均发生了较大改变。ccsA和rpoC2结合可对黄果人参和红果人参进行准确的鉴定。对26S rDNA基因序列进行比对发现,在第1737bp碱基处黄果人参为“C”,金丰人参为“G”,确定为金丰人参的SNP位点,结合ccsA基因可对韩国金丰人参进行特异性鉴别。
2.基于开发的SNP位点,在3′引入错配碱基,分别设计黄果人参和金丰人参的位点特异性引物。根据黄果人参的SNP特异性位点,设计了引物HgF(5′-CTATGCAGCTCTTCTATGTGG-3′)、HgR(5′-ATCCAACTGTGAATCAGCC-3′)和RNF(5′-GCGAAAGAATGAATCCTAAT-3′)、RNR(5′-CGGGGACTCACAGAAATA GC-3′);基于金丰人参在26S rDNA基因的SNP位点,设计了能够对金丰人参进行特异性鉴别的引物GPF(5′-CTAAGCCGGAGGTAGGATG-3′)和GPR(5′-TGACGAGGCATTTGGCTAC-3′)。
3.建立多重PCR体系,实现了黄果人参和金丰人参的鉴别。使用特异性引物对HgF、HgR和RNF、RNR对黄果人参和红果人参进行特异性鉴别,黄果人参特异性条带为217bp,红果人参的特异性条带为360bp;利用特异性引物HgF、HgR和GPF、GPR构建了实现金丰人参鉴别的多重PCR体系,结果黄果人参和金丰人参均有217bp的条带,金丰人参有568bp的特异性条带。所以可以准确地鉴定出黄果人参和金丰人参。
4.在实时荧光定量PCR中,黄果人参的特异性产物与SYBR绿色荧光染料结合产生了较强的荧光信号,而红果人参不能进行特异性扩增仅产生微弱的荧光信号。因此分别利用等位基因分型法和终点分析法建立了黄果人参的快速鉴别方法。
本论文建立的SNP分子标记方法及多重PCR体系可以准确、有效地实现中国黄果人参及韩国金丰人参的鉴别,为优质人参栽培品种“黄果人参”和韩国金丰人参鉴定开发了一种DNA分子标记方法,为黄果人参的筛选及保证其产品质量的稳定性提供了有效手段。
本论文基于前期研究在人参叶绿体的短单拷贝区(SSC)的蛋白质编码基因ccsA和长单拷贝区(LSC)的rpoC2基因中发现的黄果人参品种的两个单核苷酸多态性(SNP)位点,进行了生物信息学分析,并设计了黄果人参和红果人参的两对特异性引物,利用荧光定量及多重PCR体系构建了人参优质栽培品种黄果的SNP分子鉴定方法。此外,利用ccsA和26S rDNA基因对中国黄果人参和韩国金丰人参进行鉴定,发现了金丰人参的SNP分子标记,为实现金丰人参的鉴别,基于该位点设计了特异性引物,构建多重PCR体系,开发了可以鉴别中国黄果人参和韩国金丰人参的分子技术。主要结果如下:
1.根据前期研究中发现的黄果人参的SNP位点进行生物信息学分析发现,黄果人参在ccsA基因的第635个碱基处和rpoC2基因中的第685个碱基处均发生了非同义替换,导致其氨基酸分别从谷氨酰胺(Q)变为精氨酸(R)、甘氨酸(G)转为丝氨酸(S),进而致使其蛋白质的二级结构和三维结构均发生了较大改变。ccsA和rpoC2结合可对黄果人参和红果人参进行准确的鉴定。对26S rDNA基因序列进行比对发现,在第1737bp碱基处黄果人参为“C”,金丰人参为“G”,确定为金丰人参的SNP位点,结合ccsA基因可对韩国金丰人参进行特异性鉴别。
2.基于开发的SNP位点,在3′引入错配碱基,分别设计黄果人参和金丰人参的位点特异性引物。根据黄果人参的SNP特异性位点,设计了引物HgF(5′-CTATGCAGCTCTTCTATGTGG-3′)、HgR(5′-ATCCAACTGTGAATCAGCC-3′)和RNF(5′-GCGAAAGAATGAATCCTAAT-3′)、RNR(5′-CGGGGACTCACAGAAATA GC-3′);基于金丰人参在26S rDNA基因的SNP位点,设计了能够对金丰人参进行特异性鉴别的引物GPF(5′-CTAAGCCGGAGGTAGGATG-3′)和GPR(5′-TGACGAGGCATTTGGCTAC-3′)。
3.建立多重PCR体系,实现了黄果人参和金丰人参的鉴别。使用特异性引物对HgF、HgR和RNF、RNR对黄果人参和红果人参进行特异性鉴别,黄果人参特异性条带为217bp,红果人参的特异性条带为360bp;利用特异性引物HgF、HgR和GPF、GPR构建了实现金丰人参鉴别的多重PCR体系,结果黄果人参和金丰人参均有217bp的条带,金丰人参有568bp的特异性条带。所以可以准确地鉴定出黄果人参和金丰人参。
4.在实时荧光定量PCR中,黄果人参的特异性产物与SYBR绿色荧光染料结合产生了较强的荧光信号,而红果人参不能进行特异性扩增仅产生微弱的荧光信号。因此分别利用等位基因分型法和终点分析法建立了黄果人参的快速鉴别方法。
本论文建立的SNP分子标记方法及多重PCR体系可以准确、有效地实现中国黄果人参及韩国金丰人参的鉴别,为优质人参栽培品种“黄果人参”和韩国金丰人参鉴定开发了一种DNA分子标记方法,为黄果人参的筛选及保证其产品质量的稳定性提供了有效手段。