【摘 要】
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目的:探讨兔脱细胞软骨基质颗粒（ACM）的生物相容性,阐明其对SD大鼠脂肪干细胞（ADSCs）通过软骨内成骨方式进行骨组织重建的影响。方法:采集3月龄的新西兰白兔耳软骨,采用研磨浸泡法制取ACM备用。提取原代脂肪干细胞进行三向分化实验和流式细胞术以检测细胞干性,进行CCK-8细胞增殖实验以检测细胞增殖活性。将细胞分为对照组（ADSC）和实验组（ADSC+ACM）。将培养3天后的实验组进行Calce
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目的:探讨兔脱细胞软骨基质颗粒（ACM）的生物相容性,阐明其对SD大鼠脂肪干细胞（ADSCs）通过软骨内成骨方式进行骨组织重建的影响。方法:采集3月龄的新西兰白兔耳软骨,采用研磨浸泡法制取ACM备用。提取原代脂肪干细胞进行三向分化实验和流式细胞术以检测细胞干性,进行CCK-8细胞增殖实验以检测细胞增殖活性。将细胞分为对照组（ADSC）和实验组（ADSC+ACM）。将培养3天后的实验组进行Calcein-AM/PI荧光染色实验,在扫描电镜下观察ACM及实验组微观形态。实时定量逆转录PCR法检测（q-PCR）在成软骨诱导7天和14天时各组ADSCs中2型胶原（COL-2）、Ⅹ型胶原（COL-Ⅹ）、SOX-9、血管生成因子（VEGF）、碱性磷酸酶（ALP）、Runt相关转录因子2（RUNX-2）的m RNA表达水平。免疫印迹法检测7天和14天各组ADSCs中COL-2、COL-Ⅹ、SOX-9、VEGF、ALP、RUNX-2的蛋白表达水平。体内实验将大鼠分为四组,分别为ADSC+ACM组、ACM组、ADSC+PLGA组和空白对照组,构建大鼠牙槽骨缺损模型,并将材料与细胞按分组植入缺损。三个月后对各组大鼠上颌骨进行Micro CT和HE染色检测,取各组心肝脾肺肾进行HE染色以观察支架材料组织毒性。结果:成功制备了兔脱细胞基质颗粒。提取的SD大鼠脂肪干细胞可以进行三向分化,且具有干细胞特异性表面标志物。与对照组相比,兔脱细胞软骨基质颗粒不具有细胞毒性,且可促进细胞增殖（P＜0.05）,荧光染色实验和扫描电镜显示,脂肪干细胞可以在ACM上黏附生长。q-PCR结果显示,在7天时,与ADSC组相比,ADSC+ACM组脂肪干细胞VEGF、ALP、RUNX-2 m RNA的表达水平升高（P＜0.001）;在14天时,与ADSC组相比,ADSC+ACM组脂肪干细胞COL-2的m RNA表达升高（P＜0.05）,VEGF的表达水平升高（P＜0.01）,ALP、RUNX-2 m RNA的表达水平升高（P＜0.001）,COL-X的表达降低（P＜0.05）;与7天相比,14天时ADSC组脂肪干细胞ALP m RNA的表达水平降低（P＜0.001）、RUNX-2 m RNA的表达水平降低（P＜0.01）,COL-2 m RNA的表达水平升高（P＜0.001）,COL-X m RNA的表达水平升高（P＜0.05）;与7天相比,14天时ADSC+ACM组脂肪干细胞COL-2 m RNA的表达水平升高（P＜0.001）,COL-X m RNA的表达水平升高（P＜0.05）,VEGF、ALP、RUNX-2 m RNA的表达水平降低（P＜0.001）。免疫印迹实验显示7天时的VEGF、ALP、RUNX-2均高表达。Micro CT结果显示,实验组中新骨形成最多,且骨密度最高;ACM组新生骨较少,骨密度稍低于实验组;阳性对照组中新骨形成量低于ACM组,骨密度稍低于阴性对照组;空白对照组无新骨形成且骨吸收至穿孔。骨HE染色结果显示,实验组几乎修复到原骨面高度,新生骨中存在较多血管组织;ACM组的血管数量稍少;ADSC+PLGA组中几乎未见新生血管。心肝脾肺肾HE染色结果显示,四组未见明显差异。结论:兔脱细胞软骨基质颗粒具有三维孔洞结构,有良好的生物相容性。体外实验显示兔脱细胞软骨基质颗粒具有成软骨诱导能力以及促进血管生成能力,在早期可以抑制成骨过程的发生,有利于软骨内成骨过程的发生。体内实验显示,兔ACM支架复合SD大鼠脂肪干细胞可以有效进行骨缺损的骨重建。异种脱细胞软骨基质颗粒复合脂肪干细胞是一种有价值的新型骨再生方法。
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