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三羟基雄甾烯酮(7α,15α-diOH-DHEA)是第四代女用口服避孕药“优思明”主要成分屈螺酮的关键中间体,可通过生物转化法在去氢表雄酮(DHEA)的C7和C15位引入羟基而合成。由于优思明可靠的避孕效果以及有利于控制体重和改善肤质等优势,自2000年在欧洲上市以来,已迅速发展为全球销量第一的女用口服避孕药。然而在利用微生物转化DHEA合成7α,15α-diOH-DHEA时,普遍存在菌株羟化活性偏低、底物投料浓度和产物转化率不高的问题,严重制约了其规模化生产。因此,本论文以提高7α,15α-diOH-DHEA转化率为目标,重点分析了亚麻刺盘孢(Colletotrichum lini)ST-1甾体羟化特性,构建了高底物浓度转化体系,在此基础上研究了羟化过程中的辅酶再生,探讨了P450预诱导策略及其相关机理,主要内容总结如下:1.C.lini ST-1的底物谱和羟化特性分析。鉴于本实验诱变选育获得的C.lini ST-1催化活性高,而广域的底物谱是拓展其应用性能的前提,因此本论文选取雄甾烷、雌甾烷和孕甾烷类的8种化合物为底物,利用C.lini ST-1对其进行转化研究。结果表明,C.lini ST-1具有广域的底物谱,能对多种甾体化合物的C7、C11和C15位进行羟化,其羟化位点与母核C3和C17位取代基的类型有关。对各底物的转化液进行提取分离,最终获得了10个转化产物,其中11α,15α-diOH-4-AD、11α,15α-diOH-坎利酮和11α,15α-diOH-沃氏氧化物为首次报道,并发现C11α,15α双羟化为一种新的甾体羟化反应类型。初步探讨了C.lini ST-1转化甾体化合物的双羟化反应机制,结果表明其先在底物亲和性较高的位点引入第一个羟基生成单羟产物,继而在另一位点引入第二个羟基生成双羟产物。与其他已报道的具有甾体羟化能力的菌株相比,C.lini ST-1对各底物均具有较高的转化效率。而以DHEA为底物时转化效果最佳,当DHEA浓度为4 g·L-1,产物7α-OH-DHEA和7α,15α-diOH-DHEA总摩尔转化率可达83.6%。2.环糊精(CDs)包合转化体系的建立。转化体系中添加与底物摩尔比为1:1的甲基-β-环糊精(M-β-CD)或羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD),可将DHEA浓度由4 g·L-1提高到10g·L-1,羟化产物总摩尔转化率由63.6%(6.91 g·L-1)分别提高到74.9%(8.06 g·L-1)和78.4%(8.44 g·L-1)。基于此,本论文进一步分析了CDs对DHEA羟化的影响。通过对包合物的特性表征(X-衍射、差热扫描分析),相溶解曲线以及包合过程中热力学参数(Ks、ΔH、ΔS和ΔG)的分析,确定CDs和DHEA能以摩尔比1:1形成稳定的包合物,并显著提高DHEA的溶解度。通过扫描电镜(SEM)、透射电镜(TEM)以及细胞脂肪酸组成及含量分析,发现CDs能在不影响菌体生长的同时改善C.lini ST-1的通透性,减少转化过程中底物和产物的传质阻力。上述结果表明,CDs包合转化体系可通过提高DHEA溶解度,改善C.lini ST-1通透性,进而提高羟化产物的总摩尔转化率。3.甾体羟化关键酶细胞色素P450预诱导对产物转化率的影响。考察了诱导剂种类、浓度及添加时间等因素,结果表明在C.lini ST-1培养12 h后添加乙醇(0.6%)或DHEA(0.5%)继续诱导培养12 h,最终7α,15α-diOH-DHEA摩尔转化率可由36.2%分别提高到58.4%和56.0%,7α-OH-DHEA摩尔转化率由27.4%下降到17.6%和17.4%,同时转化周期由60 h缩短至48 h。初步探讨了醇类诱导剂的诱导机制,发现其诱导作用与醇羟基有一定的联系,同时这种诱导效应可能与醇类诱导剂的C链长度呈负相关。4.基于蛋白质组学分析的诱导机制探究。利用iTRAQ(同位素的相对和绝对定量技术)对不同诱导条件下C.lini ST-1胞内蛋白(包括胞质蛋白和微粒体蛋白)进行了定量分析,从蛋白表达水平阐明了乙醇和DHEA的预诱导机制。C.lini ST-1经乙醇诱导后,差异显著的蛋白共有50个,而DHEA诱导后的差异蛋白共有59个。对差异蛋白进行功能聚类分析,发现主要集中为甾体代谢相关蛋白、氧化还原相关蛋白、能量代谢相关蛋白和转运相关蛋白。根据iTRAQ分析结果,获得了表达量显著上调的DHEA羟化关键酶P450,为后续扩增P450基因、增强表达P450以及构建P450工程菌奠定了基础。同时,诱导剂对甾体羟化过程中传递电子的NADPH-P450还原酶、NADH-cytochrome b5还原酶以及胞内其他氧化还原相关酶的表达也有不同程度的调控作用,为后续从辅酶再生方向改进DHEA转化工艺提供了理论依据。此外,利用定量反转录PCR(qRT-PCR)技术对部分关键蛋白进行了转录水平分析,发现差异蛋白基因的转录水平与iTRAQ分析得到的蛋白差异水平基本一致,说明诱导剂主要是在转录水平提高相关蛋白的表达量。5.烟酸-葡萄糖复合辅底物偶联的NADPH再生体系的构建。基于iTRAQ分析和辅酶前体添加实验结果,发现了低比值NADPH/NADP为DHEA双羟化过程中的限速因素。以20 mmol·L-1烟酸和15 g·L-1葡萄糖为复合辅底物,在DHEA浓度为10 g·L-1,转化时间为42 h的条件下,7α,15α-diOH-DHEA摩尔转化率可达到65.2%,与对照组相比提高了80.1%。利用统计学实验设计方法对CDs包合体系、P450预诱导策略以及辅酶再生三块工艺进行了组合优化。最终,确定C.lini ST-1双羟化DHEA的最佳工艺为HP-β-CD/DHEA摩尔比0.94,乙醇添加量0.502%(v/v),葡萄糖浓度16.05 g·L-1。将此工艺应用于DHEA的转化,在DHEA浓度为10 g·L-1,转化时间为42 h的条件下,7α,15α-diOH-DHEA的摩尔转化率可达到70.2%。