第一部分结核亚单位疫苗免疫方案和IL-7、IL-15对T细胞免疫记忆的影响结核病(tuberculosis)是主要由结核分枝杆菌感染(Mycobacterzum tuberculosis)引起的一种慢性传染性疾病。其病死率在传染性疾病中已经居于第一位,是全世界的第九大死因。预防和控制传染病的最佳方式就是有效疫苗的接种,结核病难于控制的主要原因是缺乏有效的结核病疫苗。目前唯一临床批准的预防结核病的疫苗是牛分枝杆菌减毒活_活疫苗卡介苗(Bacille Calmette-Guerin,BCG)。它能够有效地控制儿童严重结核病的发生,但是,它的保护性免疫应答随着年龄的增加逐渐减弱,对成人肺结核保护效果不确定。研究报道,主要是因为BCG的持续刺激,诱导更多的寿命较短的效应记忆性T细胞(effector memory T cells,TEM)和效应T细胞(effector T cells,Teff)产生,而提供长效免疫保护效果的中央记忆性T细胞(central memory T cells,TcM)较少所致。因此,研发新的结核疫苗和有效的免疫策略来提高TCM的数量,增强长效的保护效果是目前的当务之急。蛋白亚单位疫苗是一种新型的结核疫苗,可以诱导足够多的TCM提供抗结核的长期保护效果。亚单位疫苗通常需要多次加强免疫才能取得有效的免疫保护。研究认为加强的时间间隔可以决定T细胞的类型,影响机体抗感染的免疫记忆应答。因此优化亚单位疫苗免疫接种间隔对于诱导长效的免疫记忆具有重要意义。结核亚单位疫苗常规免疫方案是免疫3次,每次间隔2-3周。目前尚缺乏对结核亚单位疫苗免疫接种方案对T细胞免疫记忆的系统研究。同时,亚单位疫苗需要佐剂的辅助来诱导较强的免疫应答,合适的佐剂能提高免疫应答的水平。目前临床上使用的佐剂很少,它们主要促进体液免疫应答。因此,研发可诱导细胞免疫应答的佐剂对于结核疫苗的开发至关重要。一些研究表明:IL-7和IL-15对于记忆T细胞的发育和维持至关重要。因此本研究我们选用了实验室前期构建的结核亚单位疫苗 ESAT6-Ag85B-MPT64190(198-Mtb8.4-Rv2626c(简称 LT70)和Mtb10.4-HspX(简称MH),它们在小鼠实验中均展现出了较强的免疫保护效果。我们应用LT70和MH,研究结核亚单位疫苗免疫方案和IL-7、IL-15对T细胞免疫记忆的影响。目的:基于上述研究背景,本研究应用结核亚单位疫苗进行下列研究:1、通过设计结核亚单位疫苗不同的免疫间隔时间,研究疫苗免疫间隔时间对T细胞免疫记忆的影响。2、此外,应用细胞因子IL-7和IL-15作为结核亚单位疫苗的佐剂,以提高结核亚单位疫苗诱导的免疫记忆和更持久的保护效果。方法:1、制备亚单位疫苗LT70,按照下列方案免疫小鼠:①0、3周和6周(0-3-6w),②0、4 周和 12 周(0-4-12w)和③0、4 周和 24 周(0-4-24w);PBS和BCG(5×105CFU)组作为对照组。各个免疫组末次免疫时间一致。2、应用腺病毒包装系统AdMax构建和包装重组腺病毒rAd-IL-7、rAd-IL-15、rAd-IL-7-IL-15 和 rAd-IL-7-IL-15(Linker);选用结核亚单位疫苗 LT70 和 MH 联合重组腺病毒 rAd-IL-7、rAd-IL-15、rAd-IL-7-IL-15 和 rAd-IL-7-IL-15(Linker),分别在第0、2、4周免疫小鼠。3、通过ELISA法检测Ag85B特异性抗体IgG1的水平;通过ELISA法检测脾脏淋巴细胞分泌IL-2和IFN-γ的水平；通过胞内染色法检测CD4+和CD8+T细胞分泌IFN-γ、IL-2和TNF-α的水平;通过延长ELISPOT检测中央记忆样T细胞的数量;利用两次抗原刺激,胞内染色法检测CD4+T细胞和CD8+T细胞分泌IFN-γ的能力,反映CD4+和CD8+中央记忆样T细胞的数量；通过EdU法检测CD4+和CD8+记忆T细胞的增殖水平;通过TB10.4 pentamer检测TB10.4特异性的CD8+记忆性T细胞的数量;通过BCG滴鼻攻击检测保护效果的差异。结果：1、0-3-6w 组(1.84±0.42)和 0-4-12w 组(1.42±0.19)两个免疫方案诱导的Ag85B特异的IgG1抗体水平较0-4-24w组(0.91±0.29)高(P<0.001和P<0.05);0-4-12w组和0-4-24w组产生的Ag85B特异的细胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-aLk0-3-6w组有明显的升高,其中0-4-12w组的IL-2 7水平最高;延长ELISPOT、两次抗原刺激后CD4+T细胞和CD8+T细胞分泌IFN-γ的能力、记忆T细胞的增殖水平等结果表明,与0-3-6w免疫方案相比,0-4-12w的免疫方案明显提高中央记忆样T细胞的数量和功能,诱导的T细胞具有较高的增殖能力;用BCG攻击试验证实LT70疫苗0-4-12w的免疫方案(5.01±0.14 Log10 CFU)诱导的免疫保护效率高于传统的0-3-6w免疫方案(5.42±0.17 Log10 CFU)。2、成功包装 了重组腺病毒 rAd-IL-7、rAd-IL-15、rAd-IL-7-IL-15、rAd-IL-7-IL-15(Linker)和rAd-vector,并获得了较高的病毒滴度,分别是8×109 PFU/ml、1× 1010 PFU/ml、9 ×109 PFU/ml、1 ×1010 PFU/ml 和 1× 1010 PFU/ml。小鼠在0、2和4周用结核亚单位疫苗LT70和MH联合IL-7、IL-15、IL-7-IL-15、IL-7-IL-15(Linker)和 IL-7+rAd-IL-15 免疫。末次免疫后 20 周通过延长 ELISPOT法,两次抗原刺激后胞内染色法检测中央记忆样T细胞的数量,通过EdU法检测记忆T细胞的增殖水平;通过TB10.4 pentameir检测TB10.4特异性的CD8+记忆性T细胞的数量,结果显示:①相比于对照组LT70+MH(186.0±30.5SFC/1 X 106 cells)和 LT70+MH+rAd-vector(211.6±22.4 SFC/1×106 cells),LT70+MH+rAd-IL-7 组(299.3±20.9 SFC/1×106 cells)、LT70+MH+rAd-IL-15 组(273.3±25.2 SFC/1×106 cells)、LT70+MH+rAd-IL-7-IL-15 组(325.6±19.7 SFC/1×106 cells)、LT70+MH+rAd-IL-7-IL-15(Linker)组(382.2±32.9 SFC/1×106 cells)和 LT70+MH+rAd-IL-7+rAd-IL-15 组(361.4±17.2 SFC/1×106 cells)淋巴细胞分泌IFN-y的细胞数量明显升高；同时,LT70+MH+rAd-IL-7-IL-15(Linker)组分泌 IFN-γ 的细胞 明 显高于 LT70+MH+rAd-IL-7 组(P<0.001),LT70+MH+rAd-IL-15 组(P<0.001)和 LT70+MH+rAd-IL-7-IL-15 组(P<0.05)。②LT70+MH+rAd-IL-7 组、LT70+MH+rAd-IL-7-IL-15 组、LT70+MH+rAd-IL-7-IL-15(Linker)和 LT70+MH+rAd-IL-7+rAd-IL-15 组脾脏淋巴细胞在两次抗原刺激后IFN-γ的分泌水平明显高于对照组LT70+MH和LT70+MH+rAd-vector。LT70+MH+rAd-IL-7 组、LT70+MH+rAd-IL-7-IL-15(Linker)组和LT70+MH+rAd-IL-7+rAd-IL-15组骨髓淋巴细胞在两次抗原刺激后IFN-γ的分泌水平也明显高于对照组LT70+MH和LT70+MH+rAd-vector。③对于CD4+T细胞来说,LT70+MH+rAd-IL-7-IL-15(Linker)组 EdU+细胞比例是 1.57%,LT70+MH+rAd-IL-7+rAd-IL-15 组为1.13%,LT70+MH+rAd-IL-7 组为 1.05%,这三组与对照组LT70+MH+rAd-vector(0.27%)相比均有明显的统计学差异;LT70+MH+rAd-IL-7-IL-15(Linker)组 EdU+细胞比例比 LT70+MH+rAd-IL-15 组和LT70+MH+rAd-IL-7-IL-15 组分别升高 1.05%和 0.670-0(P<0.001 和P<0.05)。CD8+T细胞和总淋巴细胞EdU+细胞的变化趋势与CD4+T细胞的整体一致。@LT70+MH+rAd-IL-7-IL-15(Linker)组 TB10.4 特异性的 CD8+记忆性 T 细胞比例最高,为 0.6%,其次 LT70+MH+rAd-IL-7+rAd-IL-15 组为 0.46%,LT70+MH+rAd-IL-7 组为 0.40%,LT70+MH+rAd-IL-7-IL-15 组为 0.31%,LT70+MH+rAd-IL-15 组为 0.29%,LT70+MH+rAd-vector 为 0.22%,LT70+MH 组为0.15%。末次免疫后24周检测BCG感染后的菌载量:⑤在肺脏,与对照组LT70+MH 和 LT70+MH+rAd-vector 相比,LT70+MH+rAd-IL-7 组、LT70+MH+rAd-IL-15 组 和 LT70+MH+rAd-IL-7-IL-15 组LT70+MH+rAd-IL-7-IL-15(Linker)和 LT70+MH+rAd-IL-7+rAd-IL-15 组菌载量都有明显的降低；同时,LT70+MH+rAd-IL-7-IL-15(Linker)组保护效果最好,与LT70+MH+rAd-IL-7 组和 LT70+MH+rAd-IL-15 组相比,菌载量分别降低了 0.38 Log10 CFU 和 0.50 Log10 CFU。在脾脏 LT70+MH+rAd-IL-7 组(4.73±0.95 Log10 CFU)、LT70+MH+rAd-IL-15 组(4.74±0.14Log10 CFU)和LT70+MH+rAd-IL-7-IL-15 组(4.75±0.12Log10 CFU)、LT70+MH+rAd-IL-7-IL-15(Linker)(4.58±0.12Log10 CFU)和LT70+MH+rAd-IL-7+rAd-IL-15 组(4.66±0.12Log10 CFU)菌载量比对照组LT70+MH(5.04±0.17 Log10 CFU)和 LT70+MH+rAd-vector(5.02±0.15 Log10 CFU)都有明显的降低。结论:1、结核亚单位疫苗免疫方案0-4-12w诱导产生了更多的中央记忆样T细胞,免疫保护水平也相应增强。研究结果表明延长结核亚单位疫苗的接种间隔在一定程度上有助于诱导更多的中央记忆样T细胞形成以及更好的保护效果。2、IL-7、IL-7-IL-15(Linker)和IL-7+IL-15与亚单位疫苗LT70+MH联合应用,不仅可以提高中央记忆样T细胞介导的免疫应答,而且还增强抗分枝杆菌感染的能力。第二部分IL-7和IL-15对小鼠U14宫颈癌的免疫治疗作用宫颈癌(Cervical Cancer,CC)是女性最常见的恶性肿瘤之一,在女性恶性肿瘤中发病率和死亡率位列第二。据统计,发展中国家仍是宫颈癌发生的重灾区,每年有850-%的新发病例。目前肿瘤临床主要的治疗方法是以手术、放化疗为主。宫颈癌由于较高的死亡率和缺乏有效的治疗方法而被广泛关注。近年来,许多科学家越来越致力于免疫治疗和靶向治疗来有效地促进肿瘤治疗策略的发展。本研究关注的是免疫系统调节剂细胞因子IL-7和IL-15对宫颈癌的免疫治疗作用。目的:应用重组腺病毒IL-7和IL-15(rAd-IL-7和rAd-IL-15),研究IL-7、IL-15以及IL-7+IL-15对U14宫颈癌皮下移植瘤小鼠的治疗作用及其机制。方法:1、体外培养小鼠宫颈癌细胞株U14,建立C57BL/6J小鼠U14宫颈癌腹水模型和皮下移植瘤模型。2、在U14皮下移植瘤模型基础上,应用重组腺病毒IL-7和IL-15(rAd-IL-7和rAd-IL-15)进行干预治疗,观察并检测以下指标:测量小鼠U14宫颈癌皮下移植瘤瘤体的大小；流式细胞术检测小鼠脾脏淋巴细胞CD4+CD25+Foxp3+Treg的比例;流式细胞术检测脾脏淋巴细胞CD4+T细胞和CD8+T细胞PD-1的表达水平;通过ELISA法检测血清中IFN-γ的含量;通过CCK-8法检测脾脏淋巴细胞的活力。结果:1、成功构建了 U14宫颈癌皮下移植瘤模型。2、与对照组rAd-vector和PBS相比,rAd-IL-15治疗组明显下调CD4+CD25+Foxp3+Treg(P<0.05)。3、与对照组 rAd-vector 和 PBS 相比,治疗组rAd-IL-7、rAd-IL-15 和 rAd-IL-7+rAd-IL-15 的瘤体积明显缩小(P<0.05)。4、与对照组rAd-vector和PBS相比,rAd-IL-15治疗组明显下调了 CD4+和CD8+T细胞PD-1的表达(P<0.05);rAd-IL-15组淋巴细胞的活力与对照组rAd-vector和PBS相比,有明显的升高(P<0.001)。结论:1、rAd-IL-7、rAd-IL-15 以及 rAd-IL-7 和 rAd-IL-15 联合应用均能抑制小鼠U14宫颈癌皮下移植瘤的生长。2、rAd-IL-15能明显下调U14宫颈癌皮下移植瘤小鼠脾脏淋巴细胞CD4+CD25+Foxp3+Treg的比例,降低脾脏CD4+和CD8+ T细胞PD-1的表达水平,同时也能升高血清中IFN-γ的含量,增强机体的免疫效应。因此IL-15可能是通过下调抑制性细胞和表面抑制性受体的水平,增强机体的免疫应答,进而抑制肿瘤的生长。3、rAd-IL-7则是对Treg和PD-1的水平无影响,它发挥抗肿瘤作用可能是通过其他机制,有待于进一步的研究。