目的:小儿手足口病（Hand-foot-mouth Disease,HFMD）是一种死亡率高、好发于儿童的且易伴有无菌性脑膜炎和严重的神经系统并发症的感染性疾病。近几年在我国,手足口病在丙类传染病中发病率和死亡人数最高。数据显示,大量已确证的重症病例中,肠道病毒71型（Enterovirus 71,EV71）感染是造成小儿手足口病的主要原因。目前,手足口病已成为一种对全球健康有潜在威胁的新兴传染病。众多研究表明,某些宿主因素在EV71发病机制中起关键作用^[1-4]。鉴于泛素蛋白酶体系统在细胞生理代谢、细胞增殖、周期调控、凋亡等方面的广泛作用,因此本实验从细胞泛素化与自噬角度出发,旨在研究泛素化修饰对病毒感染及其诱导的细胞自噬的调控作用。从而为进一步探讨这种调控作用对病毒复制及机体抗病毒等方面的影响奠定基础。方法:1.细胞培养RD-A细胞于含10%的胎牛血清和100U青霉素及100mg/ml链霉素的MEM完全培养基中,在37℃、5%CO₂条件下培养。每隔2日更换新鲜细胞培养液,待细胞长至90%汇合度时,用0.25%胰酶进行消化处理。2.EV71病毒TCID50滴定参照《手足口病预防控制指南（2009版）》接种浓度为5×10⁴个/ml的RD-A细胞于96孔板每孔100μl,将收集的染毒细胞培养上清做11次10倍系列稀释,每个稀释度各加入细胞培养板8孔,每孔100μl,同时用稀释液做阴性对照。培养5天后观察并记录全部孔的细胞病变（Cytopathic Effect,CPE）,再根据卡波氏公式计算出病毒滴度。3.病毒干预在染毒实验前测定病毒的TCID50,换算成空斑形成单位PFU（P1aque Forming Unit,PFU）。用血细胞计数板计数细胞后,调整细胞浓度并铺板。根据病毒量和细胞数确定感染复数（Multiplicity of Infection,MOI）。以合适的剂量和时间进行染毒实验,将病毒加入细胞培养液中,十字交叉摇动培养板混匀。染毒后合适的时间内,收集培养上清液和细胞进行滴度和VP1检测。4.质粒转染将对数期生长的细胞接种于六孔板中,1×10⁵个/ml,次日细胞融合度达到80%左右时,每孔细胞换液成含血清不含抗生素的新鲜培养基,将pPLK/GFP-Atg5-shRNA（2.5μg/孔）和转染试剂lipo6000^TM（5μl/孔）分别用无血清无双抗的培养基配置好,静置5min,将准备好的质粒和转染试剂混合,静置20min后,以250μl/孔的体系,分别将其加入相应的孔中,混合均匀,37℃、5%CO₂条件下培养,6h后换液成完全培养基。转染至合适时间,加入合适剂量的EV71病毒处理。分组情况:空白对照组（未感染组、染毒12h）、阴性对照组pPLK/GFP-shRNA（未感染组、染毒12h）;干扰组pPLK/GFP-Atg5-shRNA（未感染组、染毒12h）。作用至染毒处理后12h时,分别收集各组细胞及上清液。5.CCK-8法进行药物PYR41的细胞活性检测取对数期细胞,计数,将其密度调至1×10⁵个/ml,100μL/孔接种于96孔板;待细胞贴壁后,分别以0.0、0.1、1.0、5.0、10.0μmol/L PYR41处理RD-A细胞,各设5个复孔。培养至12h时,用CCK-8法检测细胞活性。终止培养前2 h,加入10μL CCK-8溶液（剂量为5.0 mg/ml）;在450 nm测各孔的吸光度（OD）值,计算各孔平均OD值,以对照组细胞活性为100%,计算各孔的细胞活力=（OD处理/OD对照）×100%。6.免疫印迹法检测自噬相关蛋白及病毒蛋白VP1表达将对数期生长的细胞接种于六孔板中,1×10⁵个/ml,次日细胞融合度达到80%左右时,加入PYR41（5μM）预处理12h,再感染EV71（MOI=1）,并设置不加药物处理的未染毒组和染毒组,于染毒后6h、12h,离心收集各组细胞,加入细胞总蛋白提取试剂和蛋白酶抑制剂PMSF,冰上裂解细胞后,4℃,13800rpm,离心15 min取上清,经BCA法定量并调整蛋白浓度,加入4×loading buffer经加热变性得到蛋白质样品。细胞总蛋白质经12%SDS-PAGE电泳,转移到NC膜上,5%脱脂奶粉室温封闭2 h后,分别用抗LC3-I/II（1:1000）、P62（1:2000）、VP1（1:1000）、β-actin（1:2000）于4°C孵育过夜,TBST洗涤3次,每次5min,再加入HRP标记的抗兔和抗鼠二抗（1:5000）室温孵育2 h,TBST洗3次,每次5min,ECL化学发光,底物显色,于凝胶成像仪曝光后分析结果。7.荧光定量PCR法检测病毒蛋白VP1 mRNA表达依照方法6分组情况,RD-A细胞经PYR41（5μM）处理12h,再染毒,于染毒后6h、12h,分别收集各组细胞,TRIzol法提取各组细胞总RNA;按照快速cDNA第一链生成试剂盒说明书的方法进行反转录;再以生成的cDNA为模板,进行荧光定量PCR扩增。设计并合成各个qRT-PCR引物。所有引物均由上海生工有限公司合成。PCR反应条件:95℃预变性60s;95℃15s,60℃15s,72℃60s,共40个循环。Bio-Rad荧光定量PCR仪,测定各组Cq值,三次独立重复实验,经Prism 5软件统计分析,得出目的基因与内参基因的相对比值。8.免疫荧光法检测细胞内EV71病毒数量取对数期细胞,接种于24孔板中,1×10⁵个/ml/孔,次日细胞融合度达到80%左右时,加入PYR41（5μM）预处理12h,再染毒,于染毒后3h、6h、12h,PBS洗涤三次,各组细胞分别用4%多聚甲醛,固定10 min（便于EV71染色）,PBS洗涤三次,加入0.3%TritonX-100通透10 min,PBS洗涤三次,免疫荧光封闭液（5%BSA）室温封闭30 min;吸弃封闭液,加入抗EV71（1:200）一抗,4℃,过夜,PBS洗涤3次;加入FITC标记的抗兔二抗（1:200）室温孵育30 min,PBS洗涤3次;DAPI进行核染色,PBS洗涤三次,每次5分钟,在荧光显微镜下观察并拍照,分析比较各组病毒数量的变化。9.统计学分析数据以（?）±s表示,用SPSS19.0和Sigmaplot 12.3软件进行统计分析,组间均数比较用t检验,百分比和率的比较用χ²检验,以P<0.05为差异有统计学意义。结果:1.EV71感染RD-A细胞,增加了细胞泛素化水平:免疫印迹结果显示随着病毒感染时间的增加,细胞内泛素化蛋白（Ub）s明显增加,且在12h后达较高水平（P<0.05）;同时随着EV71感染剂量的增加,细胞内泛素化蛋白（Ub）s含量逐渐增加,并在MOI=5时达较高水平（P<0.05）。2.抑制泛素化减少细胞内病毒数量:RD-A细胞预先用PYR41处理再染EV71,染毒12h时PYR41+EV71组与无药物仅EV71组比,病毒蛋白VP1含量明显减低（P<0.01）,同时荧光定量PCR分析也发现,12h时,PYR41+EV71组病毒VP1 mRNA水平与仅EV71组比较明显减低（P<0.01）。免疫荧光法通过荧光显微镜观察FITC（绿色）标记的EV71分布,也发现12h时PYR41组比仅EV71组荧光斑点数明显减少（P<0.05）。3.抑制泛素化,导致EV71诱导的自噬进程受抑:我们的前期研究发现EV71可诱导细胞自噬,且随感染时间和感染剂量增加而自噬增强。本结果显示PYR41处理RD-A细胞,发生LC3-I向LC3-II转换,尤其在12h时转换明显（P<0.01）。且PYR41加药组比单独EV71组LC3-II也明显增加（P<0.01）。为进一步验证PYR41对自噬的作用使得LC3-II累加是否由于抑制自噬晚期阶段。我们检测P62的变化,结果发现染毒后诱导P62降低;而PYR41作用后,P62降解的趋势受抑（P<0.05）。即PYR41导致自噬进程受抑,抑制溶酶体内容物的降解。4.EV71感染RD-A细胞后,自噬分子Atg5发生泛素化降解:EV71感染RD-A后,细胞内Atg5降低,12h显著降低（P<0.01）。加上泛素活化酶抑制剂PYR41后,与原未加PYR41仅EV71时相比,Atg5降低被明显抑制（P<0.05）。说明Atg5发生了泛素化降解,这一降解能被PYR41抑制。说明EV71感染后依赖于泛素化降解Atg5。5.PYR41降低细胞内病毒数量与其自噬效应有关:免疫印迹显示PYR41引起的VP1改变随着3-MA或CQ的作用发生相应增加或减低（P<0.01）,故PYR41抗病毒的作用与自噬效应有关,可以通过改变自噬而改变;同时由该结果及结果3推测PYR41对自噬及病毒的作用可能与CQ类似:抑制自噬晚期,增加病毒释放,使细胞内病毒数量减低。为证实此,我们进一步通过TCID50法检测PYR41对胞外病毒滴度的影响。发现PYR41预处理再染毒12h胞外病毒滴度明显升高（P<0.05）。6.自噬关键蛋白Atg5的减少利于增加病毒数量:EV71感染增强泛素化降解Atg5而影响自噬水平,增加了胞内病毒数量。转染质粒pPLK/GFP-Atg5-shRNA后,细胞内病毒蛋白VP1增加（P<0.05）。表明Atg5的减低可能有利于病毒复制或减少其释放。即PYR41也可通过抑制Atg5的降解而启动增强自噬早期阶段,降低细胞内病毒数量。再次验证了前期的结果。结论:泛素活化酶抑制剂PYR41抑制泛素化后,可减少细胞内病毒数量。且这种抗病毒作用与其自噬效应有关:通过抑制自噬晚期,增加了病毒的胞外释放,导致胞内病毒数量减低。同时,PYR41通过对自噬分子Atg5的泛素化降解的抑制,促进自噬早期启动,也会降低胞内病毒量。由此得出:EV71感染引起的泛素化有利于病毒复制,而这一原因可能与EV71增强自噬关键蛋白Atg5的泛素化降解而影响自噬水平有关。这些结果为我们更好地理解EV71的致病机制提供实验基础,也从泛素化的角度为预防和治疗EV71感染提供一种新的策略和思路。