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线粒体功能障碍累及肾脏进而导致肾功能异常的被统称为线粒体肾病,这类患儿对糖皮质激素及免疫抑制剂治疗效果欠佳。线粒体肾病虽然罕见,但该病已成为儿童终末期肾病的重要病因之一。近年来,遗传因素导致足细胞损伤在线粒体肾病的发病机制中备受重视。目前报道与足细胞损伤相关的致病基因达50余种,包括裂孔隔膜蛋白、细胞骨架蛋白、溶酶体蛋白、核孔蛋白复合体及线粒体蛋白等各类基因。线粒体外膜蛋白2（MTX2）是一种由核基因编码的线粒体外膜蛋白,本课题组在临床中发现1例反复大量蛋白尿的患儿,通过全外显子测序检测出该患儿MTX2基因出现1个经典剪接位点突变c.378+1（IVS6）G＞A和1个移码突变c.95（exon3）delA,相关软件分析结果提示均为致病突变。目的:探讨MTX2基因突变导致大量蛋白尿的致病机理,我们应用分子克隆技术分别构建了plko.1-MTX2-sh RNA质粒（3组）、MTX2-pcs2+质粒和两个突变位点质粒pcs2+-MTX2c.378+1（IVS6）G＞A和pcs2+-MTX2c.95（exon3）delA,转染人足细胞后通过影响MTX2蛋白的表达,研究MTX2基因沉默及两个突变位点对足细胞活力、增殖能力、ATP生成、活性氧水平、自噬及足细胞中线粒体形态及数量的影响。探讨MTX2基因沉默及突变是否会引起MTX2蛋白的功能丧失,深入揭示MTX2基因对足细胞损伤及产生大量蛋白尿的作用机制。方法:1、整理患儿的病例资料,包括现病史、既往史、个人史、家族史、实验室检查及家系相关背景的咨询与整理等,并采集患儿及父母外周血进行高通量测序,详细分析患儿临床表型和基因型的关系。2、体外培养永生化人足细胞,收集足细胞RNA并通过逆转录反应获取野生型c DNA,分别构建了3组敲低质粒及过表达质粒。通过sigma官网设计并合成3对MTX2基因（NM＿006554.4）的sh RNA引物构建plko.1-MTX2sh RNA质粒,双酶切鉴定后,构建了3组（plko.1-MTX2sh RNA-1、plko.1-MTX2sh RNA-2、plko.1-MTX2sh RNA-3）敲低质粒,分别进行条件永生化人足细胞转染,提取各实验组足细胞的RNA,进行逆转录反应获取对应的c DNA,采用q RT-PCR和蛋白免疫印迹（Western Blot）检测3组plko.1-MTX2-sh RNA质粒的敲低效率,并选取敲低低效率最佳的一组,作为本课题组后续所有实验的研究。应用分子克隆技术设计并合成MTX2基因（NM＿006554.4）克隆引物,构建pcs2+-MTX2质粒,同时利用点突变的方法构建pcs2+-MTX2c.378+1（IVS6）G＞A突变位点质粒和pcs2+-MTX2c.95（exon3）delA突变位点质粒（由公司合成）。3、体外培养永生化人足细胞并转移至细胞六孔板中,待细胞密度达到约80%时,更换六孔板中的细胞培养基,并继续置于细胞培养箱内培养48h后进行后续实验,实验分组如下:空白对照组、MTX2sh RNA组、MTX2sh RNA+MTX2-pcs2+组、MTX2sh RNA+pcs2+-MTX2 c.378+1（IVS6）G＞A组、MTX2sh RNA+pcs2+-MTX2c.95（exon3）delA组。4、采用增殖态HPC足细胞,研究MTX2基因沉默及突变位点MTX2c.378+1（IVS6）G＞A和MTX2 c.95（exon3）delA对人足细胞活力及增殖能力的影响:上述5组实验组培养48h后,通过CCK-8实验测定OD值,通过相应的公式换算得出对应的细胞活力;通过Brd U法检测各实验组足细胞增殖能力。采用分化态HPC足细胞,研究MTX2基因沉默及突变位点MTX2c.378+1（IVS6）G＞A和MTX2 c.95（exon3）delA对人足细胞ATP生成的影响:上述5组实验组培养48h后,通过ATP萤光素酶法检测各实验组足细胞中ATP生成情况。采用分化态HPC足细胞,研究MTX2基因沉默及突变位点MTX2c.378+1（IVS6）G＞A和MTX2 c.95（exon3）delA对人足细胞活性氧（ROS）生成的影响:上述5组实验组培养48h后,通过DCFH-DA探针法检测各实验组足细胞中ROS的水平。7、采用分化态HPC足细胞,研究MTX2基因沉默及突变位点MTX2c.378+1（IVS6）G＞A和MTX2 c.95（exon3）delA对人足细胞自噬的影响:上述5组实验组培养48h后,通过Western Blot检测各组足细胞中LC3BII/LC3BI蛋白的表达水平;通过m RFP-GFP-LC3双荧光慢病毒自噬检测系统检测自噬的表达。8、采用分化态HPC足细胞,研究MTX2基因沉默对人足细胞线粒体功能的影响:上述实验组培养48h后,使用线粒体荧光探针Mitotracker Green在电镜下观察线粒体数量与形态的变化。结果:1、3组MTX2 sh RNA均可有效抑制MTX2基因在人足细胞中的表达,plko.1-MTX2 sh RNA-1、plko.1-MTX2 sh RNA-2和plko.1-MTX2 sh RNA-3对MTX2m RNA表达均存在抑制。其中,plko.1-MTX2sh RNA-2的敲低效率最高,因此后续所有实验均选择了plko.1-MTX2sh RNA-2组。2、CCK-8检测细胞活力实验结果表明,同Control组相比,MTX2sh RNA组、MTX2sh RNA+MTX2 c.378+1（IVS6）G＞A-pcs2+组、MTX2sh RNA+MTX2 c.95（exon3）delA-pcs2+组的OD值明显低于空白对照组,根据相应的公式计算得知三组足细胞活力较空白对照组相比明显降低;回补了MTX2sh RNA+MTX2-pcs2+组后,足细胞活力得到拯救;Brd U法检测细胞增殖能力实验结果表明,与Control组相比,MTX2sh RNA组、MTX2sh RNA+MTX2 c.378+1（IVS6）G＞A-pcs2+组、MTX2sh RNA+MTX2c.95（exon3）delA-pcs2+组中的细胞增殖能力也相应降低,回补了MTX2sh RNA+MTX2-pcs2+组后,足细胞增殖能力得到拯救。3、ATP萤光素酶法检测足细胞ATP生成实验结果表明,同Control组相比,MTX2sh RNA组、MTX2sh RNA+MTX2 c.378+1（IVS6）G＞A-pcs2+组、MTX2sh RNA+MTX2 c.95（exon3）delA-pcs2+组的ATP生成低于空白对照组,回补了MTX2sh RNA+MTX2-pcs2+组后,足细胞ATP生成能力被拯救。4、DCFH-DA探针法检测足细胞活性氧（ROS）的实验结果表明,同Control组相比,MTX2sh RNA组、MTX2sh RNA+MTX2 c.378+1（IVS6）G＞A-pcs2+组、MTX2sh RNA+MTX2 c.95（exon3）delA-pcs2+组的ROS显著上升,回补了MTX2sh RNA+MTX2-pcs2+组后,足细胞的ROS水平有所下降。5、Western Blot检测结果表明,与Control组相比,MTX2sh RNA组、MTX2sh RNA+MTX2 c.378+1（IVS6）G＞A-pcs2+组、MTX2sh RNA+MTX2 c.95（exon3）delA-pcs2+组中足细胞中LC3BII/LC3BI蛋白比值显著上升,当我们回补了MTX2sh RNA+MTX2-pcs2+组后,足细胞LC3BII/LC3BI蛋白比值有所下降;与此同时,通过m RFP-GFP-LC3双荧光慢病毒自噬检测系统检测自噬的实验结果表明,与Control组相比,MTX2sh RNA组、MTX2sh RNA+MTX2 c.378+1（IVS6）G＞A-pcs2+组、MTX2sh RNA+MTX2 c.95（exon3）delA-pcs2+组中足细胞中线粒体自噬水平显著上升,当我们回补了MTX2sh RNA+MTX2-pcs2+组后,足细胞线粒体自噬水平有所下降。6、电镜下检测线粒体形态及数量的实验结果表明,与Control组相比,MTX2sh RNA组中足细胞线粒体出现肿胀,形态异常,线粒体嵴模糊不清甚至消失,可见自噬小体形成。与Control组相比,MTX2sh RNA组中足细胞线粒体数量平均值明显低于空白对照组（p＜0.05）。结论:MTX2基因沉默及突变位点MTX2 c.378+1（IVS6）G＞A和MTX2 c.95（exon3）delA损伤人足细胞,表现为显著抑制足细胞的增殖,同时足细胞中线粒体的结构及功能也被显著破坏。