链霉菌是一种革兰氏阳性细菌,能够产生多种具有生物活性的次级代谢产物,如抗生素、抗肿瘤物质以及免疫抑制剂等。链霉菌的次级代谢产物具有菌种特异性,自青霉素发现至今,多数重要的临床应用的抗生素均分离自链霉菌。链霉菌的基因组中一般含有多个用于次级代谢产物的生物合成基因簇。吸水链霉菌10-22(Streptomyces hygroscopicus 10-22)能够产生硫肽类抗生素-环噻挫霉素,其生物合成基因簇已被克隆、测序。吸水链霉菌10-22的近缘菌株5008(S.hygroscopicus5008)的基因组测序已经完成。序列分析表明,在5008基因组中存在与10-22的环噻唑霉素生物合成基因高度相似的基因。链霉菌FR-008(Streptomyces sp.FR-008)产生一种多烯大环内酯类抗生素-FR-008,其生物合成基因簇也已经被克隆、测序。在5008的环噻唑霉素生物合成基因簇和链霉菌FR-008的FR-008生物合成基因簇中都存在多个调控基因。本文主要对环噻唑霉素以及FR-008生物合成的调控进行研究,旨在探讨基因簇中的调控基因对相应抗生素生物合成的影响。Ⅰ硫肽类抗生素-环噻唑霉素生物合成的调控吸水链霉菌5008全基因组测序已经完成,序列分析表明,在5008基因组中存在与吸水链霉菌10-22环噻唑霉素生物合成基因高度相似的基因。生物活性测定结果表明5008能够抑制玉米小斑菌的生长;HPLC分析检测到在5008的发酵样品中具有疑似环噻唑霉素的吸收峰,且该吸收峰对应的物质是抑制玉米小斑菌生长的主要活性物质。最后通过质谱分析(MS)确认此活性物质为环噻唑霉素,说明吸水链霉菌5008能够产生环噻唑霉素,其基因组中的环噻唑霉素生物合成基因簇是一个功能性的基因簇。序列分析表明,吸水链霉菌5008的环噻唑霉素生物合成基因簇中包含三个调控基因SHJG8833、SHJG8837和SHJG8838。SHJG8833对应于10-22中的cltH,编码属于 LAL(Large ATP-binding regulators of the LuxR family)家族的调控因子,主要特征为分子量较大,分别带有一个AAAATPase结构域(N端)以及属于LuxR家族的HTH DNA结合结构域C端。SHJG8837与10-22基因簇中的cltP相对应,编码的调控因子的N端为属于XRE家族的HTHDNA结合结构域。而SHJG8838在10-22中没有对应基因,编码的调控因子的C端为属于AraC家族的HTH DNA结合结构域。我们将SHJG8833、SHJG8837和SHJG8838分别进行同框缺失,得到突变株△8833、△8837以及A8838。生物活性测定以及HPLC分析结果表明,△8833失去了环噻唑霉素的合成能力,但A8837和A8838的产素能力与野生型5008相比没有明显变化,说明SHJG8833是环噻唑霉素生物合成的关键调控基因,SHJG8837和SHJG8838则不参与环噻唑霉素生物合成的调控。通过RT-PCR以及Real-time PCR对环噻唑霉素生物合成基因的表达进行分析,结果表明,与野生型5008相比,A8833中SHJG8826-32的表达水平显著下调,而基因簇中其它基因的表达没有明显变化,说明SHJG8833只调控SHJG8826-32的转录。基因表达定量分析表明,SHJG8833对SHJG8826、SHJG8827的调控程度相近,不同于对SHJG8828、SHJG8829、SHJG8831、SHJG8832的调控。基因的共转录分析表明,SHJG8826-27、SHJG8828-32可能组成两个操纵子。我们分别对SHJG8822-32中的SHJG8829、SHJG8831以及SHJG8832进行了同框缺失突变,得到突变株A8829、A8831以及A8832。生物活性测定以及HPLC分析表明,上述突变株均失去环噻唑霉素的合成能力,证实SHJG8833所调控的SHJG8829、SHJG8831和SHJG8832是环噻唑霉素生物合成的必需基因。我们利用5’-RACE技术分别对SHJG8833、SHJG8826以及SHJG8228的转录起始位点进行了定位。EMSA试验结果表明,SHJG8833的DNA结合结构域结合SHJG8226、SHJG8827、SHJG8828以及SHJG8830的上游DNA序列。进一步的序列分析显示,SHJG8833可能的保守结合序列为CCCGNNNCCNGNN。综合以上结果,我们推测,SHJG8833可能通过直接结合在SHJG8226和SHJG8228的启动子的保守结合位点上,调控操纵子SHJG8826-27和SHJG8228-32的转录,从而控制环噻唑霉素的生物合成。Ⅱ多烯大环内酯类抗生素-FR-008生物合成的调控链霉菌FR-008产生多烯大环内酯类抗生素-FR-008。FR-008的生物合成基因簇中存在四个调控基因-fscⅠ、fscRⅡ、fscRⅢ和fcRⅣ。FscRI的N端具有一个PAS结构域,C端有一个HTHDNA结合结构域;与SHJG8833类似,FscRII、FscRIII、FscRIV同属于LAL家族的调控因子,N端具有一个AAA结构域,C端具有一个LuxR家族的DNA结合结构域。为了解fscRⅠ对FR-008生物合成的影响,我们对fscRⅠ进行了同框缺失,得到突变株△fscRI。生物活性测定以及HPLC分析结果表明,△fscRⅠ突变株失去合成FR-008的能力,说明fscRⅠ沿是FR-008生物合成的关键调控基因。利用RT-PCR以及Real-time PCR对FR-008生物合成基因的表达进行了分析,结果表明,FscRⅠ正调控fscO、pabC以外的所有结构基因以及调控基因fscRⅣ的表达,但并不调控fscRⅡ和fscRⅢ以及fscRI自身的表达。体外结合试验表明,FscRI能够结合fscRⅣ/fscMI、pabAB、fscA、fscB和fcD的启动子序列,提示上述基因是FscRI的靶基因。为了确定FscRI的DNA结合结构域(FscRIDBD)是否具有结合活性,我们对其进行了异源表达。体外的结合试验结果表明,FscRIDBD能够与靶基因启动子结合。序列分析发现,fscRIVlfscMI、fscAfscB和fscD的启动子序列上都具有一段保守的核苷酸序列,与同家族的调控因子PimM的保守结合序列CTVGGGAWWTCCCBAG相似。点突变试验证实验证了上述序列为FscRI的保守结合序列。FscRI正调控fscRIV的表达,序列分析表明,fscRIV编码一种LAL家族的调控因子,为了解fscRⅣ在FR-008生物合成中的作用,我们对fscRIV进行了同框缺失,得到突变株△/sc/RⅣ。生物活性测定以及HPLC分析结果表明,与野生型FR-008相比,△fscRIV的产素水平明显降低,表明fscRⅣ是FR-008生物合成的正调控基因。基因表达分析表明,FscRⅣ正调控fscO以外的所有结构基因的表达,但调控程度远小于FscRⅠ对相同基因的调控。FscRⅣ可以调控fscRⅠ的表达,提示FscRⅠ与FscRⅣ存在交叉调控,但 fscRⅡ、fscRⅢ的表达不受FscRⅣ的调控。我们对FR-008生物合成基因簇中的另外两个调控基因fscRⅡ、fscRⅢ的功能进行了初步研究。序列分析表明,与FscRIV类似,FscRⅡ和FscRⅢ都属于LAL家族的调控因子。为了确定fscRⅡ和fscRⅢ在FR-008生物合成中的作用,我们对二者分别进行了同框缺失突变,得到突变株△fscRⅡ、△fscRⅢ。生物活性测定以及HPLC分析表明两个突变株均失去FR-008的产生能力,说明fscRⅡ、fscRⅢ是FR-008生物合成过程中关键的调控基因。进一步的基因表达分析表明,与FscRIV类似,FscRⅡ正调控fscO 以外的所有结构基因的表达;而FscRⅢ则正调控基因簇中所有结构基因的表达,虽然对多数基因的调控程度都较弱,但对fscE、fscD以及fscMⅢ的表达调控非常显著,提示fscE、fscD、fscMⅢ可能是FscRⅢ的靶基因。FscRⅢ对其它结构基因的接近FscRⅡ和FscRⅣ的调控水平,低于FscRⅠ。基因表达分析表明,FscRⅡ、FscRⅢ以及FscRⅣ均正调控fscRⅠ的表达,提示上述调控因子对部分基因的调控可能是通过FscRⅠ实现的。另外,FscRⅡ能够负调控fscRⅢ,但不调控fscRⅣ,而FscRⅢ负调控fscRⅣ的表达,但不调控fscRⅡ。综合以上结果,我们推测,FscRⅠ、FscRⅡ、FscRⅢ以及FscRⅣ可能形成一个较为复杂的调控网络调控FR-008的生物合成。