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作为纤维素复合酶系的重要组成部分,内切-β-葡聚糖酶在可再生纤维素资源的生物转化与利用、棉织物生物整理、制浆造纸以及轻工食品等领域中应用广泛。目前常用的纤维素酶生产菌种里氏木霉(Trichoderma reesei)所产的内切-p-葡聚糖酶仅适用于酸性反应体系,其应用范围受到了很大的限制。采用基因工程技术,构建新型内切-p-葡聚糖酶高产菌株,对于纤维素酶制剂的工业化应用具有重要的推动作用。刺糙青霉(Penicillium echinulatum)可产生一种耐热、耐碱的内切-p-葡聚糖酶,具有重要的工业应用价值,但野生型刺糙青霉的产酶水平很低,难以实现规模化生产。本文以刺糙青霉的内切-p-葡聚糖酶基因(Egll)为研究对象,首先对其进行密码子优化,获得符合里氏木霉密码子偏好的新型内切-p-葡聚糖酶基因Eglln,该基因全长1175 bp,编码含387个氨基酸的成熟肽。之后将该基因置于里氏木霉强启动子Pcbhl(纤维二糖水解酶Ⅰ)及其信号肽和终止子Tcbhl(维二糖水解酶Ⅰ)之间,以pCAMBIA1300为载体骨架构建重组质粒pCB-PET,该质粒同时含有目的基因Eglln和潮霉素筛选标记。采用根瘤农杆菌介导转化技术将重组质粒pCB-PET导入里氏木霉的分生孢子中,在潮霉素抗性平板上筛选获得226个阳性转化子,进一步通过复筛获得5个优良的重组转化子。将5个转化子重复传代培养10个批次后,分别提取染色体DNA进行PCR验证,均可检测到目的基因Eglln条带,说明该基因已稳定地整合到里氏木霉基因组中。采用SDS-PAGE蛋白电泳对转化子培养液进行检测,获得了与目的基因表达产物相符的蛋白条带(约41 kDa),表明Eglln已在重组里氏木霉中成功实现了胞外表达。重组转化子在30℃,摇瓶转速200 r/min条件下培养48 h,取发酵上清液在pH8.0,60℃条件下检测,内切-p-葡聚糖酶活力可高达382.6 U/ml,为宿主菌株的22.5倍。采用分批发酵工艺,在2 m3发酵罐中对重组转化子T1进行产酶试验,其碱性内切-p-葡聚糖酶活力在96 h可达到1070 U/ml,为摇瓶条件下的2.8倍。表明发酵罐条件下溶氧、搅拌的改善有利于目的基因在重组转化子中的高效表达。酶学性质研究结果表明：该酶耐热性能较好,在70℃以下性能稳定,其最适催化温度为60℃；该酶在pH 5.0-10.5范围内稳定性较好、具有明显的催化活性,其最适pH为8.0,属于碱性纤维素酶。Ca2+对重组内切-p-葡聚糖酶有明显的激活作用,而Hg2+、Mg2+、Al3+、zn3+、Cu2+.和Fe3+在一定程度减弱酶的催化作用,其中Hg2+可以完全抑制重组内切-p-葡聚糖酶活性。本文成功地实现了刺糙青霉内切-p-葡聚糖酶基因在里氏木霉中的重组与胞外表达,有关研究结果在里氏木霉纤维素酶的定向进化以及内切-p-葡聚糖酶的工业化应用方面具有重要的促进作用。