前言　　免疫反应导致的肝损伤是诸多肝脏疾病如:自身免疫性肝炎(AIH)、病毒性肝炎，酒精性肝病等疾病发展的重要因素，T细胞在其中起到了重要的作用。刀豆蛋白A(ConA)诱发的小鼠急性肝损伤是由T细胞介导的免疫性肝损伤模型，该模型具有较强的器官特异性，与人类的自身免疫性肝炎(AIH)、病毒性肝炎等疾病相似，常用来研究上述肝细胞损伤的分子生物学机制及观察药物的疗效。炎性因子在刀豆蛋白A(ConA)诱发的小鼠急性肝损伤过程中起到了至关重要的作用，有研究发现，在ConA诱导的肝损伤模型中，炎性因子的表达明显增高。核因子κB(NF-κB)是细胞内重要的参与炎症反应的分子，当细胞接收来自细胞外的刺激时，在细胞质中的NF-κB会由原先受IκB抑制的状态下释放出来，并呈现活化状态，活化之后的NF-κB进入细胞核中并调控下游炎症反应相关因子的表达，从而参与炎症反应的发生。目前已经明确Toll样受体可以通过激活NF-κB信号通路参与炎症反应过程，以往大量的研究表明TLR2，TLR4和TLR9信号通路的激活在ConA诱导的急性肝损伤中有着举足轻重的作用。此外有研究证明，TLR2或TLR4的基因敲除减轻了ConA诱导的急性肝损伤。由于TLR在ConA诱导的急性肝损伤中的重要作用，TLR被认为是T细胞介导的肝损伤的潜在治疗靶点。　　表没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechin-3-gallate，EGCG）是从绿茶中提取的一种多酚化合物，大量的研究表明EGCG具有抗炎、抗氧化，抗癌等诸多药理活性，有研究发现，EGCG通过降低致炎因子及纤维化调节因子的转录表达而达到抑制CCL4诱导的肝炎的氧化应激及纤维化的作用。最近有结果显示EGCG能够通过抑制相关炎症因子的表达减轻ConA诱导的急性肝损伤。然而EGCG减轻ConA诱导的急性肝损伤及其抗炎的相关生物学分子生物学机制仍不十分清楚。　　本实验通过构建conA诱导的小鼠急性肝损伤模型，给予EGCG进行干预，探讨EGCG是否有保护肝脏的作用及其作用机制，为治疗免疫性肝损伤提供新的理论依据和方法。　　材料与方法　　一、材料　　雄性C57BL/6小鼠，由中国医科大学实验动物中心提供。随机分为4组:正常对照组、EGCG对照组、conA模型组，EGCG+conA模型组。EGCG对照组和EGCG+ConA模型组经灌胃给予5mg/kg的EGCG，每天两次，共10天，正常对照组和ConA模型组同时给予等体积的PBS;10天后，ConA模型组和EGCG+ConA模型组的小鼠经尾静脉注射15mg/kg的ConA，正常对照组和EGCG对照组同时给予等体积的PBS，分别于注射0h、10h、20h、30h时取各组小鼠外周血并处死取肝组织。　　二、方法　　小鼠麻醉后眼球取血，离心后ELISA检测ALT和AST的水平。　　检测各组小鼠肝组织中SOD、MDA及GSH的含量。　　小鼠肝组织一部分经4％的多聚甲醛固定后，用石蜡包埋，切片后HE染色，观察肝组织形态学改变。　　Western-blot法检测IκBα和p-IκBα及NF-κB的表达及TLA2、TLA4和TLA9蛋白的表达;EMSA法检测NF-κB的结合活性。　　小鼠肝组织用免疫组化方法检测TLA2、TLA4和TLA9的表达。Real-timePCR法检测炎性因子TNF-α，IFN-γ和IL-10及TLA2、TLA4和TLA9的mRNA的表达情况。　　三、统计学分析　　统计资料采用SPSS16.0软件进行分析处理，计量资料以以均值±标准差表示，采用单因素方差分析，进行正态分布及方差齐性检验，两两比较采用t检验，P＜0.05具有统计学意义。　　实验结果　　一、各组小鼠肝组织的病理变化　　HE染色显示:正常对照组和EGCG对照组小鼠肝细胞形态正常，细胞无水肿，肝小叶结构完整，汇管区正常，无炎性细胞浸润;conA模型组造模10h后出现肝细胞水肿，肝小叶结构破坏，汇管区炎性细胞浸润，随着时间的推移，损伤逐渐加重，于20h达峰值;EGCG+ConA模型组肝脏病理损伤较conA模型组明显减轻。　　二、EGCG对ConA诱导的肝损伤小鼠转氨酶及氧化应激的影响　　ConA模型组小鼠血清转氨酶升高，于注射20h时达高峰，EGCG治疗后数值明显下降。MDA在conA模型组小鼠肝组织中含量增多，而SOD和GSH的含量下降;EGCG治疗后上述数值均趋于正常。　　三、EGCG对小鼠肝组织中炎性指标（TNF-α，IFN-γ和IL-10）及NF-κB的影响　　Realtime-PCR结果显示:　　ConA模型组小鼠TNF-α，IFN-γ和IL-10表达较正常对照组和EGCG对照组明显升高，EGCG治疗后三者表达均显著下降。　　Westernblot结果显示:　　正常对照组和EGCG对照组细胞核内少许NF-κB表达，两者无明显差异;conA模型组小鼠NF-κB的表达明显增多，而EGCG治疗后其表达显著减少。　　EMSA结果显示:　　ConA模型组NF-κB结合活性较对照组明显升高，EGCG治疗组活性显著下降。　　四、EGCG对小鼠肝组织中TLR2、TLR4和TLR9表达的影响　　免疫组化结果显示:　　TLR2、TLR4和TLR9在正常对照组和EGCG对照组的胞浆内较少表达，ConA模型组三者的阳性表达明显增多，EGCG治疗后其表达显著下降。　　Westernblot结果显示:正常对照组和EGCG对照组细胞核内少许表达，ConA模型组小鼠的表达明显增多，而EGCG治疗后其表达显著减少。　　Realtime-PCR结果显示:ConA模型组小鼠TLR2、TLR4和TLR9mRNA表达较正常对照组和EGCG对照组明显升高，EGCG治疗后三者表达均显著下降。　　结论　　1、ConA诱导的小鼠急性肝损伤模型的肝组织中TNF-α，IFN-γ和IL-10均高表达，EGCG治疗后上述炎性指标显著下降。　　2、NF-κB在ConA诱导的小鼠急性肝损伤模型中高表达，且结合活性增高;EGCG治疗后可以使NF-κB表达明显下降，结合活性亦显著下降。　　3、TLR2、TLR4和TLR9在ConA诱导的小鼠急性肝损伤模型肝组织中高表达;EGCG可以使小鼠的上述指标明显下调。　　4、EGCG对ConA诱导的急性肝损伤模型小鼠有保护作用，其机制可能与抑制炎性因子的表达，抗氧化，抑制NF-κB及TLR2、TLR4，TLR9的表达有关。