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目的轮状病毒(Rotavirus, RV)是引起婴幼儿腹泻的最主要病原,同时也可引起肠外脏器损害,致病率及病死率均较高,但目前对其发病机制仍未完全清楚,也未能研制出很满意的疫苗。本实验通过猴RV SA-11感染生后7天昆明乳鼠,建立RV感染的乳鼠动物模型,并用该动物模型研究轮状病毒腹泻及肠外脏器损伤发病机制,为RV疫苗研制及更好地防治RV感染提供理论依据。方法以恒河猴胚肾细胞(MA-104)培养猴RV SA-11,扩增,空斑实验滴定病毒滴度,分装,-80℃保存备用。实验动物选用生后7天清洁级昆明乳鼠,实验组每只乳鼠经口接种0.1 ml病毒培养细胞冻融液(RV含量为3.75×10~7 PFU/ml),而对照组每只乳鼠经口接种0.1 ml正常无病毒对照培养细胞冻融液。感染后1～7天(Day Post Inoculation,DPI),每日观察乳鼠活动情况、毛色光泽、大便变化、体重变化,并收集大便经ELISA检测其中RV抗原,空斑实验滴定其中RV滴度,建立轮状病毒感染动物模型。在1、2、3、4、7、10、15 DPI各时间点取小肠组织,苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin,HE)染色光镜下观察形态学改变,并用图像分析软件(Image pro plus 5.1, IPP5.1)测定空肠绒毛高度和隐窝深度;取3 DPI空肠组织2.5%戊二醛固定后送电镜切片观察肠上皮细胞超形结构改变;取3 DPI空肠石蜡切片用免疫组化染色观察乳鼠空肠RV抗原分布;取1、2、3、4、10、15 DPI空肠石蜡切片用Phalloidine-TRITC染色观察小肠绒毛丝状肌动蛋白分布并用IPP5.1测量、SAS软件统计分析;取3 DPI空肠石蜡切片用Tunnel法检测肠上皮细胞原位凋亡,以研究RV肠炎腹泻发病机制。取3 DPI乳鼠脑、肺、心、胰、肝、肾组织,石蜡切片HE染色光镜和电镜观察病理改变;用免疫荧光法检测RV抗原在各脏器分布;以Phalloidine-TRITC染色观察1、2、3、4 DPI乳鼠心脏丝状肌动蛋白分布并用IPP5.1测量、SAS软件统计分析;用Tunnel法检测3 DPI乳鼠肝脏和心脏原位细胞凋亡;以巢式RT-PCR(nested reverse transcription polymerase reaction ,nRT-PCR)法检测组织中RV RNA分布,以研究RV感染肠外脏器损伤机制。结果RV SA-11在MA-104细胞内增殖良好,感染后1天即可出现病变,表现为拉网、细胞圆缩、脱落,4天病变可达到+++～++++。空斑实验滴定所收集的病毒液,滴度为3.75×10~7噬斑形成单位(Plaque Forming Unit,PFU)/ml。RV感染后乳鼠出现腹泻,活动减少,皮毛光泽差,肛周可见粪便污染。腹泻潜伏期为1～5天,持续约1～5天,感染后第3～4天腹泻最重,感染后第8天所有乳鼠停止腹泻。感染后乳鼠大便RV抗原阳性且便中有病毒排出,1～7 DPI大便RV滴定结果依次为3.75×103、6.25×10~3、1.25×10~4、5.00×10~4、6.25×10~3、8.75×10~3、8.75×10~2 PFU/ml,乳鼠腹泻越严重,其大便RV滴度也越高。RV腹泻对乳鼠体重未见明显影响。乳鼠感染RV后光镜下见小肠肠壁和绒毛轻度充血水肿,绒毛萎缩,绒毛上皮细胞广泛空泡状变性,未见有明显炎性细胞浸润及肠壁坏死等表现。电镜下见绒毛上皮细胞空泡变性部位呈大量脂滴样结构,微绒毛排列紊乱或脱落,而细胞间连结未见明显结构改变。1、2、3、4、7、10、15DPI空肠石蜡切片HE染色并经IPP5.1测量及SAS软件统计分析显示:RV感染后实验组和对照组空肠绒毛高度比较1、2 DPI有统计学意义(P<0.05),提示绒毛有萎缩;2、3、4 DPI可见两组肠隐窝深度有差异(P<0.05),实验组肠隐窝增生明显;1、2、3、4 DPI肠绒毛高度和肠隐窝深度比值有差异(P<0.05),表明其后绒毛上皮增生趋于正常。免疫组化检测提示RV抗原分布主要在小肠绒毛的上部。Palloidine丝状肌动蛋白染色显示1、2 DPI时实验组乳鼠空肠组织丝状肌动蛋白含量有明显减少,但其后则两组无显著差异。原位细胞凋亡检测显示RV感染后空肠上皮细胞凋亡增加。3 DPI时取乳鼠脑、肺、心、肝、胰、肾组织,光镜下显示轻度心肌间质性水肿、轻度心肌细胞浊肿,肝组织轻度充血、肝细胞空泡样变性,肾小球和肾间质轻度充血、肾小管轻度浊肿,而脑、肺、胰未见明显改变。电镜下见心肌细胞肌丝溶解,滑面内质网扩张,线粒体内室肿胀,核周间隙增宽。免疫组化显示除脑组织外,肺、心、肝、胰、肾组织中均检测到RV抗原。Phalloidine丝状肌动蛋白染色显示1、2、3、4 DPI心肌丝状肌动蛋白含量改变不明显。原位细胞凋亡检测显示肝细胞凋亡明显,而心肌细胞未见明显凋亡。nRT-PCR检测显示脑、肺、心、肝、胰、肾组织中均检测到RV核酸。结论RV感染昆明乳鼠动物模型建立成功。RV主要感染小肠成熟绒毛上皮细胞。腹泻的发生与小肠绒毛上皮细胞骨架损害、微绒毛损害、细胞凋亡脱落和绒毛萎缩相关,但与肠上皮细胞间连接损害关系不大。RV可由肠道向全身播散,并造成肠外多脏器不同程度损害。造成肠外脏器损害的机制不除外病毒局部增殖破坏组织的可能,也可能由于病毒结构蛋白或非结构蛋白作用造成,如影响丝状肌动蛋白合成,破坏细胞骨架等。病毒感染引起细胞凋亡增加也是造成肠外脏器损害的机制之一。