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基因工程菌工业化生产过程中,重组质粒不稳定性现象,一直是一个亟待解决的既有理论意义又有实际应用价值的重要问题。重组质粒的不稳定性一般具有2种表现形式,一种是结构(序列)不稳定性,即重组质粒上某一区域的DNA序列发生插入、缺失、重排、修饰等现象,导致其表观生物学功能的丧失;另一种是分离(分配)不稳定性,是指整个重组质粒DNA分子从受体细胞中逃逸或丢失的现象。在质粒不稳定性的研究过程中,人们关注最多的,通常是质粒的分离不稳定性。以非抗生素为选择压力的质粒解离后致死系统(PSK,post-segregational killing system)是解决质粒分离不稳定性的有效方法之一,即该系统并不直接参与质粒DNA的复制,而是在质粒发生不稳定分离后,杀死无质粒的子代细胞,从而在细胞传代中保持质粒稳定的性状。来源于大肠埃希菌质粒R1的hok/sok质粒PSK系统,编码一种毒素蛋白的mRNA(hok mRNA),以及一段可以阻止该mRNA表达的反义RNA(sok RNA)。其作用机理基于“毒剂与解毒剂”的原则,即在含质粒细胞中,sok RNA能够迅速与hok mRNA结合,从而抑制了hok mRNA的表达;而当细胞质粒丢失后,sok RNA逐渐降解,而hok mRNA仍留在细胞中,不断聚集并充分表达,产生的毒素蛋白杀死细胞,因而保证了存活的细胞中均含有质粒,提高稳定性。为了深入研究hok/sok基因对于维持质粒载体pACYC184的稳定性,本实验以低拷贝质粒pACYC184为载体,将稳定性基因hok/sok插入到载体上的BamHⅠ位点,构建重组质粒稳定系统pACYC184-hok/sok,并转化大肠杆菌DH5α。根据已构建的重组质粒pACYC184-hok/sok的DNA全序列,设计特异性引物,通过长片段PCR扩增,获得含有hok/sok△274T的目的基因与载体pACYC184的DNA序列的融合基因片段,并进一步构建重组质粒pACYC184-hok/sok(M),使之与重组质粒pACYC184-hok/sok构成对照。其中,hok/sok△274T即hok/sok第274位碱基缺失,破坏了hok/sok基因的可阅读框,抑制了sok反义RNA的形成,从而使sok RNA不能有效地与hok mRNA结合。对所构建的含质粒pACYC184-hok/sok的重组菌DH5α,含质粒pACYC184-hok/sok(M)的重组菌DH5α,以及含质粒pACYC184的工程菌,进行反复的传代培养,以考察重组菌株的分离不稳定性及宿主细胞连续分裂时无抗生素选择压力的添加对质粒稳定性的影响。其具体方法如下:在不含抗生素的LB培养基中,进行连续传代,每隔一定的世代间隔,将收获的细菌菌液适量稀释,涂布于空白LB平板。再分别挑取单菌落100个点种至含氯霉素的LB平板,对氯霉素敏感的重组菌菌落其质粒细胞已经丢失;同时挑取具有氯霉素抗性的单个菌落,采用标准碱裂解法抽提质粒,以进一步确定质粒的存在。并将传代前后的重组质粒经SphⅠ酶切鉴定,并设置空载体pACYC184作对照。为了进一步检测hok/sok基因的引入对于宿主细胞生长的影响,绘制两重组菌生长曲线,含质粒pACYC184的工程菌与重组菌平行培养作对照。试验结果表明,在无抗生素筛选压力下连续传代,含质粒pACYC184-hok/sok的重组菌DH5α传至第135代时质粒稳定率仍是100%;而含质粒pACYC184-hok/sok(M)的重组菌DH5α仅传至第15代,质粒丢失率就达到98%,由此说明hok/sok基因能够显著提高所在质粒系统的稳定性。重组质粒pACYC184-hok/sok传代前后的质粒SphⅠ酶切图谱没有发生变化,进一步的DNA序列测定表明,插入的hok/sok基因没有发生突变。重组质粒pACYC184-hok/sok(M)传代前后的质粒SphⅠ酶切结果虽然没有发生变化,但由于其传代时间较短,因而不具有遗传学意义。生长曲线的测定结果发现,重组菌DH5α(pACYC184-hok/sok)生长较快,与含原质粒pACYC184的工程菌生长曲线相似,而重组菌DH5α(pACYC184-hok/sok(M))则生长缓慢,其低生长速率与该重组质粒的不稳定性密切相关。综合以上结果表明,包含hok/sok稳定系统的质粒pACYC184-hok/sok,其稳定性明显高于无hok/sok稳定系统的质粒pACYC184和pACYC184-hok/sok(M)。在宿主细胞连续分裂过程中,重组质粒pACYC184-hok/sok具有良好的分离稳定性,而重组质粒pACYC184-hok/sok(M)则具有较高的分离不稳定性。质粒pACYC184虽表现出一定的分离不稳定性,但仍然能够在无抗生素选择压力条件下,在50世代内保持质粒的基本稳定遗传,该性能已经足够满足工业生产的需要。总之,通过在载体pACYC184上成功构建一个hok/sok质粒平衡致死系统,使质粒的稳定性大为提高,从而为进一步研究外源基因的稳定表达和促进基因工程菌的生产提供有效的研究工具。