我室早期研究发现，核糖体基因(rDNA)区可能是安全有效的基因打靶位点。目前，我室已经成功构建多个人类核糖体基因区靶向载体，并且经过打靶能定点整合不同的外源基因至多种细胞类型的rDNA区。近期还突破性获得了定点整合外源基因FVⅢ和FⅨ并能长期稳定表达的人胚胎干细胞株，为遗传性疾病的基因治疗提供了坚实基础。为推进rDNA区打靶结合干细胞在基因治疗临床前的应用，对该策略实施的安全性验证就显得尤为重要。因此，我室拟打靶小鼠胚胎干细胞（mESCs）的rDNA区，再通过将打靶后的mESCs发育为子代小鼠，从而观测rDNA打靶是否对胚胎发育及成体各阶段产生影响。在此方案指导下，本研究将针对mESCs的rDNA区设计并构建打靶载体，再尝试打靶mESCs，以获得rDNA区定点整合外源基因的mESCs。同时，在本室利用干细胞进行血友病基因治疗的基础上，本研究还将定向分化mESCs至内皮细胞，为之后在小鼠体内开展血友病的基因治疗研究奠定基础。　　第一部分：小鼠核糖体基因区靶向载体的构建以及mESCs打靶研究。　　目的：针对小鼠核糖体基因区+2527至+6875位点设计小鼠核糖体基因区靶向载体并初步验证其其打靶效率。　　方法：⑴针对小鼠核糖体基因区位点从+2527位点至+6875位点设计同源臂。将此DNA片段分成两部分扩增，分别构建成T-AR1与T-AR2载体，再利用酶切位点拼接成全长的同源臂，构建成pMr载体。⑵分别扩增Neo与GFP两个筛选基因，通过酶切连接克隆至pMr同源臂中的EcoRⅠ位点，并引入Cre-loxp系统中的loxp序列，从而构建成小鼠rDNA区打靶载体pMrn及pMr-GFP。⑶分离MEF细胞作为mESCs滋养层细胞，并在LIF的作用下，建立稳定的mESCs培养体系。⑷将pMrn打靶载体利用电穿孔技术打靶mESCs，利用“启动子陷阱”策略富集同源重组子，用G418对打靶细胞进行筛选。　　结果：①酶切以及测序鉴定结果表明成功构建pMrn、pMr-GFP两个小鼠rDNA区打靶载体;②在滋养层细胞及LIF的维持下，mESCs细胞间致密，成典型克隆样生长，边界清晰，未见明显的细胞，且碱性磷酸酶检测成阳性;③pMrn通过电穿孔技术转染单细胞化后mESCs，利用G418药物筛选，大部分细胞脱落死亡，两个星期后筛选出抗性克隆。　　结论：成功构建了含loxp位点的小鼠核糖体基因区靶向载体，打靶mESCs后能筛选到抗性克隆。　　第二部分：体外mESCs向内皮细胞定向分化技术。　　目的：建立体外mESCs向内皮细胞定向分化的技术，为后续在小鼠体内开展血友病的基因治疗研究奠定基础。　　方法：⑴联合VEGF生长因子利用EGM-2内皮细胞分化培养基，再经EB途径诱导mESCs向内皮细胞定向分化。⑵用RT-PCR检测由mESCs细胞分化而来的内皮细胞特异性标志基因的表达情况。⑶利用流式分析鉴定内皮细胞表面标记物的表达情况。　　结果：①mESCs在形成EB后，经分化培养基的诱导下，逐渐贴壁生长出单层细胞，2天后可观察到部分克隆中出现鹅卵石样的典型内皮样细胞。②抽提分化而来的内皮细胞RNA，经RT-PCR可以检测到内皮特异性标志基因VE-Cadherin、PECAM、FLK-1的表达。③流式细胞仪检测分化后细胞表明标志物，发现CD29阳性率达到98％， CD105的阳性率达到5％。　　结论：建立了mESCs细胞向内皮细胞分化的技术方法。