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研究背景miR-21(microRNA-21;微小RNA-21)是最早发现的微小RNAs(microRNAs；miRNAs)之一，并且在所有人类恶性肿瘤中均表达上调。研究表明，miR-21在乳腺癌细胞中显著高表达，并且与癌细胞的增长、迁移和侵袭能力等有关，发挥着类似原癌基因的作用。然而，关于miR-21调控乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力的具体机制，目前并不明确。肿瘤干细胞(Cancer stem cells，CSCs)由于具有干细胞特征(例如：自我更新能力、无限增殖能力以及侵袭和迁移能力等)，被认为是肿瘤产生、进展、复发和转移的根源。研究表明，乳腺癌组织中存在一小部分的乳腺癌干细胞(Breast cancer stem cells，BrCSCs)，可以通过乙醛脱氢酶1阳性(ALDH1+；ALDHbright)和(或) CD44+/CD24-/low表型分选出来，也可以通过无血清悬浮培养乳腺球(mammosphere)实验将其富集、纯化。上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)可以使得癌细胞侵袭周围组织，逃逸至血管，随后建立远处转移灶，因此也和乳腺癌的进展与转移正相关。从分子水平来讲，经历EMT的细胞获得更高的间质表型，同时出现上皮表型标志物[例如：E-钙粘蛋白(E-cadherin)]的低表达和间质表型标志物[例如： N-钙粘蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)和Alpha-平滑肌肌动蛋白(Alpha-smooth muscle actin，α-SMA)]的高表达。研究表明，乳腺癌的EMT与三阴(ER-、PR-和HER-) basal-like亚型乳腺癌以及BrCSCs相关。目前研究表明，在乳腺癌癌细胞的迁移、侵袭等进展过程中，miR-21与BrCSC特征和EMT表型均相关。这就意味着在miR-21调节乳腺癌进展和转移等恶性行为的过程中，可能有BrCSC特性的获得和EMT过程的参与，但相关机制并不明确。在本研究中，我们证明了miR-21在其调节乳腺癌癌细胞迁移和侵袭过程中对BrCSC特性以及EMT表型的影响，并探讨了相关分子机制。第一部分miR-21表达对EMT和BrCSC特性的影响目的：探讨改变miR-21表达对EMT和BrCSC特性的影响。方法：我们首先通过转染hsa-miR-21mimics进入MCF-7细胞建立MCF-7/miR-21细胞；通过转染hsa-miR-21antagomir进入MDA-MB-231细胞建立MDA-MB-231/anti-miR-21细胞。然后通过检测上皮表型标志物(E-cadherin)、间质表型标志物(N-cadherin、Vimentin和α-SMA)的表达以及癌细胞迁移与侵袭能力来评价EMT表型；通过检测BrCSC标志物(ALDH1和CD44)的表达、mammosphere成球能力来评价BrCSC特性。结果：miR-21过表达上调了间质表型标志物(N-cadherin、Vimentin和α-SMA)的表达、下调了上皮表型标志物(E-cadherin)的表达，即miR-21过表达诱导了癌细胞的EMT化；同时，miR-21过表达增加了ALDH1+表型和CD44+/CD24-/low表型的BrCSC-样细胞比例，并且显著提高了癌细胞的mammosphere成球能力，即miR-21过表达诱导了癌细胞的CSC特性。正好相反，拮抗miR-21逆转了MDA-MB-231细胞的EMT化以及BrCSC表型。结论：我们从正反两反面证实，miR-21在乳腺癌细胞中，能够通过调控EMT过程和BrCSC特性影响其细胞迁移与侵袭能力。第二部分miR-21在BrCSC-样细胞中的表达及其对相关EMT的影响目的：建立更为纯化的BrCSC-样细胞研究模型；探讨miR-21对BrCSC-样细胞相关EMT表型的影响。方法：我们通过无血清悬浮培养技术，由MCF-7亲本细胞(Parentcells，P)依次培养出一代mammosphere (1-S)、二代mammosphere(2-S)、三代mammosphere (3-S)和四代mammosphere (4-S)，鉴定出较为纯化的BrCSC-样细胞研究模型。然后按照第一部分的方法检测miR-21对BrCSC-样细胞相关EMT表型的影响。结果：在长程培养出的1-S、2-S、3-S、4-S中，3-S细胞呈现出较高的BrCSC表型(ALDH1+和CD44+/CD24-/low)、mammosphere成球能力以及细胞迁移与侵袭能力，被认为是更为富集BrCSC-样细胞的研究模型，被应用于进一步研究；3-S细胞较P细胞上调了间质表型标志物(N-cadherin、Vimentin和α-SMA)的表达、下调了上皮表型标志物(E-cadherin)的表达，即在3-S细胞的培养过程中伴有癌细胞的EMT化；同时，miR-21和HIF-1α在3-S细胞中均显著高表达。更有意义的是，在3-S细胞中，拮抗miR-21在一定程度上逆转了其EMT表型、下调了HIF-1α表达、抑制了细胞迁移与侵袭能力。结论：BrCSC-样细胞的培养、富集过程中伴有细胞的EMT化及HIF-1α的过表达；并且，这二者都被miR-21所调控。第三部分miR-21调控EMT和BrCSC特性的分子机制研究目的：探讨miR-21调控EMT表型和BrCSC特性的相关分子机制。方法：根据第一部分的方法建立MDA-MB-231/anti-miR-21细胞；通过转染siPTEN沉默PTEN表达；分别通过LY294002和U0126抑制AKT和ERK1/2信号通路；然后，再根据第一、二部分的方法检测EMT和BrCSC表型的变化。结果：拮抗miR-21上调了PTEN表达、失活了AKT和(或) ERK1/2信号通路；沉默PTEN阻断了miR-21逆转的EMT和BrCSC表型，即PTEN是miR-21调控EMT和BrCSC表型的下游靶点；LY294002(AKT抑制剂)和U0126(ERK1/2抑制剂)均能在一定程度上抑制EMT和BrCSC表型，即AKT和ERK1/2信号通路均是miR-21调控EMT和BrCSC表型的下游信号通路。结论：miR-21靶向PTEN，经由AKT和(或) ERK1/2信号通路调控乳腺癌EMT和BrCSC表型。