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第一部分糖尿病肾病miRNA-mRNA调控网络的生物信息学分析[目的]糖尿病肾病(DN)是糖尿病严重的微血管并发症。本部分研究利用生物信息学的方法对DN基因以及miRNA表达谱进行差异分析构建miRNA-mRNA调控网络,以寻找新的DN分子标志物及可能的治疗靶点,为DN的进一步诊治提供依据。[方法]1.从NCBI的GEO数据库下载糖尿病肾病基因表达数据集GSE30528,miRNA表达谱数据集GSE51674数据,并对数据进行处理。2.差异表达分析,根据校正后p值和|log 2 FC|值确定差异表达基因(DEGs)和差异表达 miRNA(DEmiRNAs)。3.使用STRING在线数据库筛选DEG蛋白质产物的蛋白质-蛋白质相互作用对(PPI),Cytoscape用于构建PPI网络。用Cytoscape提供的MCODE插件识别PPI网络中的主要模块。4.使用DAVID在线数据库对模块中的差异基因进行GO和KEGG功能富集分析。5.生物信息学预测软件miRanda、RNAhybrid预测DEG的靶miRNA并取交集,从DEmiRNA列表中筛选出DEG的预测靶标,获得miRNA-mRNA作用对,使用Cytoscape构建miRNA-mRNA调控网络。6.miRNA-mRNA网络中筛选出连接度最高的DEGs并与其相关的miRNA。[结果]1.在GSE30528数据集中,共筛选出1153个DEG;在GSE51674数据集中,共筛选出 107 个 DEmiRNA。2.据STRING数据库构建了由1076个DEG和7839个相互作用对组成的PPI网络。MCODE确定的得分靠前的3个模块由下调50个基因产物及上调106个基因产物组成。3.对上下调DEG的GO生物学过程分析结果表明,差异基因参与了炎症反应、免疫反应、凋亡过程、细胞增殖、程序性细胞死亡、MAPK级联反应、ERK1\2级联、NF-κB转录因子活性、细胞外基质的组织等过程的调控;对上下调DEG的KEGG功能富集分析结果表明,这些差异基因参与了 ECM-受体相互作用、PI3K-Akt信号通路、补体和凝血级联反应、Ras信号通路、细胞黏附分子、原发性免疫缺陷等。4.前3个模块的138个DEG被84个DEmiRNA所靶向,它们的相互作用对构建形成miRNA-mRNA调控网络。其中NLRP3在该调控网络中连接度最高,miRNA-29a是NLRP3的相互作用靶标,与对照样品比较,DN中miRNA-29a的表达上调约3倍。[结论]通过对糖尿病肾病的miRNA、mRNA数据集分析,构建了由许多潜在的相互作用对构成的miRNA-mRNA调控网络,其中NLRP3连接度最高,最终确定了miRNA-29a-NLRP3靶向作用关系,通过功能富集分析并结合文献,确定它们可能在调控程序性细胞坏死方面发挥作用。第二部分miR-29a靶向调控NLRP3抑制高糖下足细胞焦亡促进自噬并抑制凋亡的机制研究[目的]1.高糖下肾小球足细胞的焦亡、自噬及凋亡三者间的关系;2.在足细胞中验证所筛选的miRNA-29a-NLRP3靶向关系;3.观察miRNA-29a对高糖下足细胞焦亡、自噬及凋亡水平的调控。[方法]1.细胞培养传代、分化、同步化、转染及分组:采用成熟的小鼠肾小球足细胞株(购自ATCC公司),细胞于含20U/ml γ-干扰素、5%胎牛血清1640培养基中,在33℃细胞培养箱中培养传代。然后将细胞转入不含γ-干扰素的5%胎牛血清1640培养基,37℃培养使足细胞分化10-14天后使用。种植于平皿的细胞在不含胎牛血清的DMEM培养液中培养24小时,使其同步化,根据不同的实验目的进行分组与设计。①足细胞中焦亡、自噬、凋亡调控关系:正常对照组(5.5mM),高糖凋亡组(30 mM),高糖凋亡加NSA(焦亡抑制剂)组,高糖凋亡加3MA(自噬抑制剂)组,高糖凋亡加ZVAD-FMK(凋亡抑制剂)组。细胞转染及分组,用脂质体2000转染miRNA-29a-mimics以及 negative control mimics。②用于靶点验证时,分为 miRNA-29a mimics、miRNA-29a negative control两组。③miRNA-29a过表达对调控足细胞的焦亡、自噬、凋亡及增殖能力,分为正常对照组、高糖组、miRNA-29a-mimics组。2.实验①时:CCK8测各组细胞增殖;Western blot测高糖下足细胞焦亡蛋白caspase-1的表达变化;qRT-PCR测各组自噬分子LC3-II及焦亡标志分子IL-18、IL-1β、caspase-1和GSDMD mRNA表达;流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡。3.实验②时:qRT-PCR测高糖下足细胞的miRNA-29a表达变化;Western blot测高糖下足细胞NLRP3的表达变化;双荧光素酶实验验证miRNA-29a-NLRP3相互作用。4.实验③时:CCK8测miRNA-29a过表达时足细胞增殖变化;qRT-PCR测miRNA-29a过表达组自噬分子LC3-II及焦亡标志分子caspase-1、IL-18、IL-1β mRNA表达;流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡。5.实验数据采用SPSS 23.0软件进行统计分析,符合正态分布的计量数据用x±s表示,两组间比较用t检验,多组间比较用单因素方差分析,P<0.05被认为差异具有统计学意义,所有实验均重复3次。GraphPad Prism 7对实验数据进行绘制。[结果]1.实验①:高糖凋亡组足细胞增殖活性在24h、48h、72h、96h均低于正常对照组(P<0.05);ZVAD-FMK、NSA可明显提高足细胞在高糖环境中增殖活性,减少细胞凋亡(P<0.05);而3MA可抑制足细胞高糖下的增殖活性,增加细胞凋亡(P<0.05)。与正常糖对照组比较,高糖组中焦亡蛋白caspase-1表达上调(P<0.05)。与高糖组相比,NSA处理组足细胞中自噬标志分子LC3-Ⅱ mRNA的表达显著上调(P<0.01),3MA处理组足细胞LC3-Ⅱ的表达明显降低(P<0.01),NSA处理组足细胞中焦亡标志分子IL-18、IL-1β、caspase-1和GSDMD mRNA的表达明显下调(P<0.01)。高糖组足细胞早期凋亡率高于正常对照组,而ZVAD-FMK处理、NSA处理可明显降低足细胞在高糖环境中凋亡率,而3MA可明显升高足细胞的凋亡率。2.实验②:高糖组的miRNA-29a表达水平显著低于正常对照组(P<0.01),而NLRP3表达水平显著高于正常对照组(P<0.05)。NLRP3野生型载体与miRNA-29a mimics共转染组相比于对照组荧光素酶活性明显下降(P<0.01);而NLRP3突变型载体与miRNA-29a mimics共转染组相比于对照组荧光素酶活性无明显变化。miRNA-29a mimics组相比于其阴性对照组,NLRP3的表达水平显著下调(P<0.01)。这表明miRNA-29a可直接靶向抑制足细胞中NLRP3的表达。3.实验③:高糖组足细胞增殖活性在24h、48h、72h、96h均低于正常对照组,增加细胞凋亡(P<0.05);而miRNA-29a mimics可明显提高足细胞在高糖环境中增殖活性,减少细胞凋亡(P<0.05)。与高糖组相比,miRNA-29a mimics组足细胞中自噬标志分子LC3-II mRNA的表达水平上调,焦亡标志分子IL-18、IL-1β、caspase-lmRNA的表达明显下调,并降低足细胞凋亡率。[结论]1.高糖作用下足细胞焦亡、凋亡水平增加;焦亡抑制剂可以上调高糖下足细胞自噬水平,并可以下调其细胞凋亡;自噬抑制剂可以上调细胞凋亡;而凋亡抑制剂不能调控高糖下足细胞自噬、焦亡。即焦亡组分可负调控足细胞自噬水平并正调控凋亡,自噬组分可负调控足细胞凋亡。2.高糖作用下足细胞miRNA-29a水平下调;miRNA-29a可直接靶向作用于NLRP3。3.miRNA-29a可靶向NLRP3下调高糖环境下足细胞的焦亡,减轻炎症反应,上调足细胞的自噬水平并下调凋亡,发挥对足细胞的保护作用,这为DN治疗靶点提供新的策略与实验基础。第三部分维持性血液透析患者死亡的影响因素分析[目的]分析维持性血液透析住院患者死亡终点事件的影响因素,为改善维持性血液透析患者的长期预后提供理论依据。[方法]回顾性队列研究。纳入2011年1月至2020年7月在昆明医科大学第一附属医院本部血液透析中心规律血透大于3个月的252例终末期肾脏病(ESRD)住院患者。收集患者人口学资料、临床一般资料、实验室指标、心脏彩超检查结果。Kaplan-Meier法估计生存率,Log-rank检验比较组间差异,Cox回归分析维持性血液透析患者死亡的影响因素。[结果]1.研究共纳入252例ESRD血液透析住院患者,纳入患者平均年龄55.43±16.85岁,男性63.5%,合并糖尿病患者占32.5%;透析病因排列靠前的为:糖尿病肾病(29.4%),其次为原发性肾小球疾病(18.3%)。中位随访时间21.5月,死亡80例(31.75%)。2.死亡组年龄、铁蛋白(FRT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、估计肾小球滤过率(eGFR)高于存活组,白蛋白(ALB)、血肌酐(Scr)、甲状旁腺激素(PTH)、每博输出量(SV)、Kt/V低于存活组(P<0.05)。其余指标差异无统计学意义。3.KM生存曲线显示维持性血液透析患者的1年、3年、6年的生存率分别为79.1%、62.2%、47.1%。其中位生存时间为70.3个月。4.Log-rank检验显示中位数分组年龄、SV、ALB、LDL-C、APTT、总铁结合力(TIBC)、FRT、转铁蛋白(TRF)及性别、合并2型糖尿病组间比较P<0.05。5.多因素 Cox 回归分析表明:年龄(HR 5.228,95%CI 1.575-14.166)、SV(HR 0.208,95%CI 0.072-0.595)、LDL-C(HR 0.269,95%CI 0.096-0.758)、FRT(HR 4.65,95%CI 1.532-14.118)与维持性血液透析患者的死亡终点预后独立相关(P<0.05)。[结论]本中心1年、3年、6年的生存率分别为79.1%、62.2%、47.1%。年龄、SV、LDL-C、FRT与维持性血液透析患者预后独立相关(P<0.05)。年龄、FRT是维持性血液透析患者死亡终点事件的危险因素;SV、LDL-C是维持性血液透析患者预后的独立保护因素。