【摘 要】
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目的:本研究旨在探究牡荆素对庆大霉素诱导的内耳毛细胞损伤的保护作用机制,为预防和治疗氨基糖苷类抗生素的耳毒性提供新的靶点和理论依据。方法:在体实验选用C57小鼠,腹腔注射庆大霉素与呋塞米联合给药10天,建立小鼠药物耳毒性模型;体外实验采用庆大霉素10mM处理HEI-OC1细胞24小时进行造模。通过ABR测试检测小鼠的听力阈值变化情况;鬼笔环肽染色检测小鼠内耳毛细胞缺失情况;透射电镜(TEM)检测内
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目的:本研究旨在探究牡荆素对庆大霉素诱导的内耳毛细胞损伤的保护作用机制,为预防和治疗氨基糖苷类抗生素的耳毒性提供新的靶点和理论依据。方法:在体实验选用C57小鼠,腹腔注射庆大霉素与呋塞米联合给药10天,建立小鼠药物耳毒性模型;体外实验采用庆大霉素10mM处理HEI-OC1细胞24小时进行造模。通过ABR测试检测小鼠的听力阈值变化情况;鬼笔环肽染色检测小鼠内耳毛细胞缺失情况;透射电镜(TEM)检测内耳毛细胞内线粒体损伤情况;DCFH-DA检测HEI-OC1细胞内活性氧(ROS)水平;JC-1染色检测HEI-OC1细胞内线粒体膜电位(MMP);流式细胞术检测HEI-OC1细胞的活性氧水平和凋亡情况;慢病毒转染检测相关蛋白表达;蛋白质免疫印迹检测Epac1、Rap1、Bax、Cleaved caspase-3(CC3)、NOX4、Drp1、MFN2 等蛋白的表达水平。结果:在体实验结果显示,庆大霉素与呋塞米联合用药后,通过ABR实验检测显示小鼠的听力阈值明显上移,表明小鼠的听力损伤明显;同时鬼笔环肽染色结果显示小鼠的内耳毛细胞缺失严重。牡荆素预处理后可降低小鼠听力阈值上移,保护庆大霉素导致的小鼠听力损伤,并可减少小鼠内耳毛细胞缺失。蛋白免疫印迹的实验结果发现,庆大霉素处理后,模型组小鼠耳蜗组织中Epac1蛋白表达与对照组相比显著上调,引起下游Rap1活化;同时氧化应激蛋白NOX4表达上调,凋亡蛋白CC3表达增加,牡荆素处理组可抑制小鼠耳蜗组织中Epac1蛋白表达和下游Rap1活化,降低NOX4和CC3的表达水平,提示牡荆素可抑制庆大霉素处理导致的内耳毛细胞氧化损伤和凋亡。透射电镜结果显示,庆大霉素诱导造模后小鼠内耳毛细胞内线粒体外膜轮廓模糊,线粒体内嵴断裂严重,部分受损严重的线粒体甚至出现空泡化,WB结果显示,线粒体相关动力学蛋白MFN2表达下调,Drp1表达上调;牡荆素处理组可通过下调Epac1减轻庆大霉素诱导的小鼠内耳毛细胞内线粒体超微结构的损伤并保护线粒体功能。另外使用Epac1的激动剂8-CPT上调Epac1后使内耳毛细胞内的氧化应激和线粒体损伤进一步加重,从而加重庆大霉素诱导的小鼠内耳毛细胞的损伤,而Epac1抑制剂ESI-09下调Epac1后可减轻庆大霉素诱导的小鼠内耳毛细胞的损伤。体外结果显示,通过CCK8实验我们发现牡荆素预处理可以保护HEI-OC1细胞活力免受庆大霉素影响;DCFH-DA检测结果显示,牡荆素可明显降低庆大霉素导致的HEI-OC1细胞中的活性氧水平升高,同时蛋白免疫印迹实验显示,牡荆素可抑制HEI-OC1细胞内氧化应激的相关蛋白NOX4的表达;JC1染色结果显示牡荆素可显著升高庆大霉素导致的HEI-OC1细胞线粒体膜电位的降低,WB结果显示,牡荆素预处理后HEI-OC1细胞内线粒体相关功能蛋白MFN2的表达显著上调,Drp1的表达显著下调,并抑制凋亡蛋白Bax、CC3的表达,减轻细胞凋亡。此外,在体外实验中,当使用Epac1激动剂8-CPT预处理HEI-OC1细胞后,蛋白Epac1和Rap1的表达明显上调,同时氧化应激相关蛋白NOX4和凋亡蛋白CC3的表达都随之上调,线粒体相关动力学蛋白MFN2表达下调,Drp1表达上调;DCFH-DA检测结果也显示Epac1激动剂处理后,细胞内活性氧水平显著升高;JC1检测结果显示Epac1激动剂处理后,细胞内线粒体膜电位显著降低;流式细胞术的结果显示,Epac1激动剂处理后HEI-OC1细胞凋亡数显著增加。当使用Epac1抑制剂ESI-09预处理后,蛋白Epac1和Rap1的表达显著下调,同时氧化应激相关蛋白NOX4和凋亡蛋白CC3的表达都随之下调,线粒体相关动力学蛋白MFN2表达上调,Drp1表达下调;DCFH-DA检测结果也显示Epac1激动剂处理后,细胞内活性氧水平显著降低;JC1检测结果显示Epac1激动剂处理后,细胞内线粒体膜电位显著升高;流式细胞术的结果显示,Epac1激动剂处理后HEI-OC1细胞凋亡数显著减少。当使用慢病毒转染沉默HEI-OC1细胞内Epac1蛋白表达,证实了 Epac1参与了庆大霉素损伤过程。结论:上述结果显示,牡荆素可减轻庆大霉素诱导的小鼠内耳毛细胞损伤,保护小鼠的听力损失,其潜在保护机制可能与下调Epac1的表达,抑制细胞内氧化应激,保护细胞线粒体功能,抑制细胞凋亡有关。
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