论文部分内容阅读
目的:肺癌是全世界癌症相关死亡的最主要原因,每年以超过20万新病例的速度增长,呈现出非常高的发病率和死亡率。在中国,肺癌也已经取代肝癌成为恶性肿瘤死亡的首要原因。目前,绝大多数的肺癌在确诊时已经是晚期且无法治愈,现有的治疗措施均表现出较差的预后。因此,寻找新的肺癌早期诊断标志物和治疗靶标对于肺癌的预防、早期诊断、治疗及预后具有极为重要的临床意义。DNA甲基化是一种表观遗传的调控方式,它能通过引起染色质的结构、DNA的稳定性、DNA的构象及转录因子与其相应基因的相互作用来实现对基因调控的目的。在正常细胞中,原癌基因去甲基化可引起该基因的异常上调表达并促进癌变;而抑癌基因的甲基化则会引起相应基因的沉默或者表达缺失,这些都会导致抑癌基因的失活,引起肿瘤生长。由于基因DNA的甲基化状态改变是先于其表达水平的变化的,因此相关基因的DNA甲基化状态有望成为一个癌症早期诊断的标志物。NF-κB家族具有调节细胞增殖、炎症、侵袭、迁移等多种功能,所以其信号通路的精细有序调控对维持包括细胞生长、免疫应答、炎症反应和细胞清除等多种正常生理过程十分重要。最近认为该通路的异常是癌症发生发展的重要原因之一。在对NF-κB家族成员NF-κB2基因组区域进行生物信息学分析后,我们发现在其启动子区域有一CpG岛,提示该基因的转录可能受到甲基化修饰的影响。此外,我们还发现在该基因的第11和第12外显子之间内含子区域还存在一段富含57个CpG位点的岛,经过前期的荧光报告基因试验证实,此区域对该基因行使一定的增强子功能。为此我们对Brunner最近报道的全基因组Methyl-Seq结果进行了分析,NF-κB2基因CpG岛在不同细胞内存在甲基化状态差异。与单纯的CpG岛相比,这种差异甲基化区域更强烈地提示其附近基因受到甲基化调控的影响。本研究,希望通检测NF-κB2在癌细胞中表达是否有差异及其甲基化状态,来初步探讨NF-κB2甲基化状态成为肺癌治疗靶标的可能性。方法:1.采用实时荧光定量PCR方法分别对人正常支气管上皮细胞株HBE、小细胞肺癌细胞株NCI-H446、肺腺癌细胞株A549和肺鳞癌细胞株SK-MES-1中NF-κB2基因的mRNA表达情况进行检测,以确定NF-κB2表达是否有差异。2.采用Western Blot技术检测NF-κB2前体蛋白p100的表达情况,从蛋白水平确定其表达差异。3.对UCSC数据库进行挖掘,确定NF-κB2两个区域的CpG岛,设计扩增产物介于250~400bp的引物以便于随后对该基因进行甲基化测序。4.采用BSP方法分别检测肺癌细胞和正常支气管细胞中甲基化状态。结果:1. NCI-H446、A549和SK-MES-1中NF-κB2mRNA较在HBE中表达更高。2. p100蛋白在3种肺癌细胞中较HBE细胞均上调表达。3.经过重亚硫酸氢钠修饰后测序表明,4种细胞株中NF-κB2两个区域所扩增片段的CpG位点均呈非甲基化状态。结论:1. NF-κB2mRNA和蛋白水平在3种肺癌细胞中均显著升高,提示NF-κB2在肺癌的发生发展起着重要作用。2.在肺癌细胞和正常支气管细胞中NF-κB2基因的两个区域CpG到均未呈现出差异甲基化,提示甲基化修饰未直接参与该基因的表达调控,可能存在其他相关的表观遗传学调控机制,有待进一步的探索。