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人ndrg2(N-myc downstream regulated gene 2)基因是本课题组用消减杂交法从人脑内克隆得到的一个抑癌候选基因,已被Gen Bank收录,登录号为AF159092。它定位于染色体14q11.1-11.2,具有两个亚型,分别编码含有357个氨基酸残基和含有371个氨基酸残基、分子量约为43kDa的蛋白质。ndrg2为Ndrg基因家族成员之一,该家族成员有4个:ndrg1,ndrg2,ndrg3, ndrg4,且该基因家族成员的氨基酸组成在从低等生物到高等生物的进化中有相当高的保守性,以上提示该基因家族在细胞的生命过程起着重要作用。本课题组初步研究结果显示,该基因在多种正常组织中高表达,而在某些肿瘤组织和肿瘤细胞系中低表达或无表达,比如发现该基因在肺癌和肝癌中的表达明显低于相应的癌旁组织,还发现该基因在体外可抑制多种肿瘤细胞系的生长,如瞬时转染胶质瘤细胞系BT325具有抑制细胞增殖的功能,推测该基因可能与肿瘤的发生发展有关,因此提出ndrg2可能为新的候选抑癌基因。但其作用的具体机制尚不清楚。首先,本课题构建了两种人ndrg2亚型原核重组体pPROEX-HTb-ndrg2并进行表达、纯化、浓缩和鉴定。根据人ndrg2基因序列设计合成特异引物,PCR扩增,亚克隆入6×His融合表达载体pPROEX-HTb,在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导融合蛋白的表达,并用Protino Ni-TED Resin进行纯化。试验结果表明构建的重组质粒经酶切后分别可见约1100bp大小的片段,与预期结果一致,基因测序结果表明序列正确。在IPTG的诱导下重组体分别表达出分子量约45kd(含多克隆位点及His标签)的表达产物,Western blot结果证实重组6×His融合蛋白可与抗-ndrg2蛋白抗体发生特异性反应;并通过Protino Ni-TED Resin成功获得了纯化蛋白。通过本试验,两种人ndrg2亚型基因分别被亚克隆至6×His融合表达载体pPROEX-HTb中,并获得成功表达和纯化,为该蛋白的生物活性及抑瘤作用的研究奠定了基础。其次,本课题对纯化的ndrg2-357以及ndrg2-371两种蛋白进行抑制肿瘤作用活性的检测。首先我们大量诱导表达ndrg2-357以及ndrg2-371两种蛋白,并采用Protino Ni-TED Resin进行纯化,采用超滤离心管进行蛋白的浓缩以及蛋白缓冲液的替换,定量后进行体外试验检测其对胶质瘤U251、BT325及肺腺癌A549等肿瘤细胞的抑制作用,观察ndrg2-371蛋白的抗肿瘤活性,并于ndrg2-357蛋白做初步对比,观察两种蛋白的抗肿瘤作用的强弱趋势。体外试验结果表明ndrg2-357以及ndrg2-371两种蛋白对U251、BT325及A549等肿瘤细胞具有明显的抑制作用,两种蛋白的抑制肿瘤作用强弱尚未见明显差异。