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目的:慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是呼吸系统最常见的慢性炎症性疾病之一。近年来随着对COPD炎症的研究日益深入,发现多种炎性细胞、细胞因子参与了COPD的发生发展。抑制炎细胞活性已成为治疗COPD的研究热点之一。核转录因子-κB(nuclear factorκB,NF-κB)是一种可诱导的炎症转录因子,对炎细胞的活性和炎症因子的合成起很重要作用。抑制NF-κB活化,可抑制炎细胞释放炎性介质,最终抑制炎症反应的瀑布效应。脂多糖(lipopolysacacharide,LPS)是G-菌外膜的一种大分子物质,可以激活炎症细胞中炎症转录因子的活性,诱导促炎因子的大量生成,放大炎症反应。血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide,VIP)是一种广泛存在于中枢和周围神经系统重要的神经肽,具有广泛的生物学作用。VIP阳性神经纤维广泛分布于呼吸道内,VIP作为非肾上腺素能非胆碱能抑制性神经递质或神经调节因子,参与呼吸道多种生物学功能的调节,其中包括抑制炎细胞的活性。大量研究表明VIP能抑制炎细胞释放多种炎性介质,其部分机制是通过阻止核转录因子NF-κB的活化而实现的。而VIP是否对COPD同样有抗炎作用如何目前还不清楚。本研究采用COPD患者外周血单个核细胞(peripheralblood mononuclear cell,PBMC)为研究对象,应用VIP干预LPS刺激前后的COPD患者PBMC,比较细胞中NF-κB和TNF-α的变化,从细胞水平上探讨VIP对COPD的抗炎作用,为临床应用VIP或其模拟物治疗COPD提供理论依据。方法:选取正常人和COPD急性加重期(AECOPD)患者为研究对象,两组在性别、年龄和吸烟指数均有可比性。无菌条件下,抽取两组人群肘静脉血5 ml,置于肝素抗凝(25 u/ml)管中,应用淋巴细胞分离液,分离出PBMC。1免疫细胞化学方法检测单个核细胞内NF-κB的表达.将PBMC用无血清1640培养液调节细胞浓度为2.0×106个/ml置入48孔培养板中,每孔0.5 ml。COPD组随机分为4组:①空白对照组;②VIP组:VIP终浓度为10-8 M;③LPS组:LPS终浓度为1 mg/L;④VIP+LPS组:培养液中加入终浓度为10-8 M的VIP,20分钟后加入终浓度为1 mg/L的LPS。正常组仅用1640培养液培养。上述配好的液体分别培养1.5小时后收集细胞,离心(800 rpm,10 min 4℃),弃去上清,甩片干燥,冷丙酮固定,做免疫细胞化学,检测单个核细胞内NF-κB p65的表达。2放射免疫方法检测细胞上清液中的TNF-α的浓度:提取出的单个核细胞用无血清1640培养液调节细胞浓度为2.0×106个/ml置入48孔培养板中,每孔0.5 ml。随机分为4组:①空白对照组;②VIP组:VIP终浓度分别为0、10-10 M、10-9 M、10-8 M、10-7 M、10-6 M。③LPS组:LPS终浓度为1 mg/L.④VIP+LPS组:培养液中加入终浓度为10-8 M的VIP,20分钟后加入终浓度为1 mg/L的LPS。正常组仅用1640培养液培养。各组分别培养8小时后,4℃低温水平离心机离心(2000 rpm,5 min),取细胞上清,-80℃保存,放射免疫法检测TNF-α的含量。3应用SPSS13.0软件对结果进行统计学处理,数据以均数±标准差( )表示。正常组与COPD的空白对照组比较采用两样本t检验,COPD各组间比较采用单因素方差分析(One way ANOVY),如差异有显著性进一步用Student- Newman-Keuls(SNK-q)检验,p<0.05表示有统计学意义。结果:1免疫细胞化学结果表明:①正常组NF-κBp65蛋白表达水平明显低于AECOPD空白对照组(p<0.05);②AECOPD各组中,四组细胞核中NF-κB p65蛋白表达水平比较,有明显差异(p<0.01)。③LPS刺激PBMC后,细胞核中NF-κB p65蛋白表达明显高于空白对照组(p<0.01);④VIP组NF-κB p65蛋白表达低于空白对照组(p<0.05);⑤VIP +LPS组NF-κB p65蛋白表达水平低于LPS组,(p < 0.05);⑥空白对照组与VIP+LPS组比较,差异无统计学意义(p>0.05)。2放射免疫法测定PBMC上清液中TNF-a含量变化:①正常组TNF-a含量明显低于AECOPD空白对照组(p<0.05);②AECOPD各组中,四组细胞上清液中TNF-α的含量比较有明显差异,(p<0.01);③LPS刺激PBMC后,细胞上清液中TNF-α的含量明显高于空白对照组(p < 0.01);④VIP组TNF-α的含量低于空白对照组(p<0.05);⑤VIP+ LPS组TNF-α的含量低于LPS组(p<0.05);⑥空白对照组与VIP+LPS组比较,差异无统计学意义(p>0.05)。3放射免疫法测定PBMC上清液中TNF-α含量与VIP浓度的相关性:随着VIP浓度升高,TNF-a含量逐渐降低。VIP在10-6M、10-7M、10-8M时、TNF-α的含量均明显低于10-9M组、10-10M组和0M组(p < 0.05)。结论:1 NF-κB和TNF-α参与了COPD的炎症反应。2 VIP可抑制AECOPD患者炎细胞内炎性转录因子NF-κB活化并抑制炎细胞释放TNF-α,且对TNF-α的抑制作用具有浓度依赖性。