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背景和目的:糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病患者最常见和最严重的多种并发症之一。中国有大约4亿糖尿病患者和20-30%的这些患者将进展到DN,以及20-40%的DN患者会进展到终末期肾脏病,这严重危害人体健康。因此对于DN的发病机制以及治疗的研究一直以来是各国学者们密切关注的焦点。相关研究人员已经表明DN的发病机制主要与非酶促造成糖化,蛋白激酶C激活,多元醇途径激活,肾血流动力学变化,血脂异常,高血压,氧化应激,血管活性物质,细胞因子和其他几个遗传因素相关。同时慢性微炎症状态在DN的发生和发展中也起到关键作用。巨噬细胞是炎症反应的主要调节细胞之一,早期DN的肾脏组织中可发现巨噬细胞的浸润,激活的巨噬细胞除产生损伤介质外,其是否通过其它机制进一步加重肾损伤近年来也引起极大关注。在糖尿病中,肾脏浸润的巨噬细胞和肾脏系膜细胞之间存在异常相互作用,这被认为是DN发病机制的一个重要方面。近来,一种新的细胞间通讯方式—外泌体(exosome)引起了人们的极大关注。外泌体是由细胞产生和释放的脂质双层膜结合囊泡,其中包含多种分子,如蛋白质,脂质,DNA,mRNA和microRNA等。已有研究报道外泌体在DN发病中起重要作用。相关研究显示在高糖共培养的巨噬细胞和系膜细胞的环境相较系膜细胞单培养的环境下,系膜细胞可高表达炎症因子以及纤维化因子。这提示高糖可能通过巨噬细胞分泌的某种物质促进系膜细胞的活化并参与到糖尿病肾病的纤维化过程中。那么,高糖是否是通过调控巨噬细胞分泌外体来调节系膜细胞的功能?本研究中利用体外高糖刺激巨噬细胞产生的外泌体,分别从体内、体外,细胞和分子水平观察外泌体如何在巨噬细胞和系膜细胞间发挥媒介作用从而参与到肾脏炎症和纤维化的改变。方法(1)取30mmol/L的高糖作为高糖组(HG组),同时设置正常糖浓度组(NC组)和甘露醇渗透压对照组(MC组)。刺激巨噬细胞24小时后,利用试剂盒提取外泌体。提取成功后,用透射电镜鉴定外泌体形态和Western Blot方法检测外泌体标记蛋白的表达。(2)鉴定成功后,将外泌体作为刺激物与系膜细胞共培养。共培养前先确定刺激的浓度和刺激的时间。选择高糖刺激巨噬细胞分泌的外泌体组(HG-Exo组)作为观察对象,设置10μg/ml,20μg/ml,30μg/ml和40μg/ml四组观察,共培养24小时后,收集系膜细胞提取蛋白,采用Western Blot方法检测系膜细胞细胞外基质Col-IV、FN和α-SMA的表达,根据分析结果,最终确定30μg/ml作为刺激的终浓度。以30μg/ml作为刺激浓度,再设置0h,6h,12h,24h和48h五个时间点进行观察,同样是采用Western Blot方法检测系膜细胞细胞外基质Col-IV、FN和?α-SMA的表达,根据分析结果,最终确定24h作为最终的刺激时间。(3)确定好刺激终浓度和时间后,利用PKH67标记巨噬细胞源外泌体与系膜细胞共培养24小时后,激光共聚焦显微镜下观察其能否被系膜细胞摄取。(4)将NC组、MC组和HG组提取的外泌体作为刺激物,以30μg/ml的浓度与系膜细胞共培养24小时,分别标为正常糖刺激巨噬细胞源外泌体组(NC-Exo组)、甘露醇刺激巨噬细胞源外泌体组(MC-Exo组)和高糖刺激巨噬细胞源外泌体组(HG-Exo组)。24小时后分别观察外泌体对系膜细胞增殖功能、分泌细胞外基质、分泌炎症因子和转分化的影响。(5)通过CCK8试验和Edu试验观察系膜细胞的增殖功能。(6)通过实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)方法、Western Blot方法、激光共聚焦方法和ELISA方法检测系膜细胞细胞外基质分泌情况。(7)通过实时荧光定量PCR方法、Western Blot方法和ELISA方法检测系膜细胞炎症因子分泌情况。(8)通过Western Blot方法和激光共聚焦方法检测系膜细胞转分化情况。(9)实时荧光定量PCR方法检测巨噬细胞、系膜细胞以及外泌体内TGF-β1mRNA的动态变化。(10)通过Western Blot方法检测TGF-β1/Smad3通路是否参与系膜细胞功能的改变。(11)通过TGF-β1 siRNA转染巨噬细胞后提取的外泌体与系膜细胞共培养来验证TGF-β1 mRNA在巨噬细胞和系膜细胞相互作用间的媒介作用。(12)TGF-β1 siRNA转染后观察系膜细胞分泌细胞外基质、分泌炎症因子和转分化的变化。(13)通过Western Blot方法检测转染后TGF-β1/Smad3通路蛋白表达情况。(14)通过Western Blot方法和激光共聚焦方法检测转染后系膜细胞细胞外基质分泌情况。(15)通过Western Blot方法和激光共聚焦方法检测转染后系膜细胞转分化情况。(16)通过Western Blot方法检测转染后系膜细胞炎症因子分泌情况。(17)将NC、MC和HG组提取的外泌体利用小鼠尾静脉注射到小鼠体内,共8周,隔日一次,8周后收集小鼠的血尿标本用于测定生化指标,收集小鼠的肾脏用于观察肾脏病理改变、免疫组化检测系膜区基质沉积情况和Western Blot方法检测TGF-β1/Smad3通路蛋白和细胞外基质Col-IV和FN的表达情况。结果(1)透射电镜下观察到的外泌体均为双层膜样结构,形状为圆形或者类圆形,直径为40nm-100nm,大小相对均一,均匀散布于视野中,这与文献中报道的典型的外泌体形态一致。(2)各组提取的外泌体均有标志蛋白CD63、TSG101的表达,但无内质网分子伴侣蛋白Calnexin表达,表明各组提取的外泌体均无细胞成分。(3)激光共聚焦显微镜显示,PKH67标记的外泌体能够被系膜细胞摄取。(4)CCK8试验和Edu试验显示HG-Exo组系膜细胞较NC-Exo组增殖明显,差异有统计学意义(P<0.05)。(5)荧光定量PCR显示HG-Exo组系膜细胞较NC-Exo组细胞外基质Col-IV mRNA和FN mRNA增多,差异有统计学意义(P<0.05)。Western Blot显示HG-Exo组系膜细胞较NC-Exo组细胞外基质Col-IV和FN增多,差异有统计学意义(P<0.05)。激光共聚焦显示HG-Exo组系膜细胞较NC-Exo组荧光强度增加。ELISA显示HG-Exo组系膜细胞较NC-Exo组细胞外基质Col-IV和FN增多,差异有统计学意义(P<0.05)。(6)荧光定量PCR显示HG-Exo组系膜细胞较NC-Exo组炎症因子TNF-α、IL-1β和MCP-1 mRNA增多,差异有统计学意义(P<0.05)。Western Blot显示HG-Exo组系膜细胞较NC-Exo组炎症因子TNF-α、IL-1β和MCP-1增多,差异有统计学意义(P<0.05)。ELISA显示HG-Exo组系膜细胞较NC-Exo组TNF-α、IL-1β和MCP-1增多,差异有统计学意义(P<0.05)。(7)Western Blot显示HG-Exo组系膜细胞较NC-Exo组α-SMA增多,差异有统计学意义(P<0.05)。激光共聚焦结果显示HG-Exo组α-SMA较NC-Exo组荧光强度增大。(8)巨噬细胞和系膜细胞内TGF-β1 mRNA都是动态增加的,差异有统计学意义(P<0.05),外泌体内可检测到TGF-β1 mRNA。Western Blot显示巨噬细胞和系膜细胞内均有TGF-β1/Smad3通路的表达。且HG组较NC组,差异有统计学意义(P<0.05),HG-Exo组较NC-Exo组,差异有统计学意义(P<0.05)。(9)Western Blot显示TGF-β1 siRNA转染后TGF-β1 siRNA+HG-Exo组较HG-Exo组TGF-β1/Smad3通路蛋白表达减少,差异有统计学意义(P<0.05)。(10)Western Blot显示TGF-β1 siRNA转染后TGF-β1 siRNA+HG-Exo组较HG-Exo组Col-IV和FN表达减少,差异有统计学意义(P<0.05)。激光共聚焦显示TGF-β1 siRNA转染后TGF-β1 siRNA+HG-Exo组较HG-Exo组Col-IV和FN荧光强度减弱。(11)Western Blot显示TGF-β1 siRNA转染后TGF-β1 siRNA+HG-Exo组较HG-Exo组炎症因子TNF-α和TGF-β1表达减少,差异有统计学意义(P<0.05)。(12)Western Blot显示TGF-β1 siRNA转染后TGF-β1 siRNA+HG-Exo组较HG-Exo组α-SMA表达减少,差异有统计学意义(P<0.05)。激光共聚焦显示TGF-β1siRNA转染后TGF-β1 siRNA+HG-Exo组较HG-Exo组α-SMA荧光强度减弱。(13)小鼠HbA1c和肾重/体重HG-Exo组较NC-Exo组差异无统计学意义(P>0.05),24小时尿蛋白排泄率HG-Exo组较NC-Exo组比较差异有统计学意义(P<0.05)。(14)HE染色和PAS染色提示HG-Exo组肾小球系膜细胞增多,基质增多,部分基底膜增厚。(15)免疫组化结果显示HG-Exo组肾小球系膜区细胞外基质Col-IV和FN沉积明显多于NC-Exo组。(16)Western Blot显示细胞外基质Col-IV和FN与TGF-β1/Smad3通路蛋白在HG-Exo组表达增多,较NC-Exo组差异有统计学意义(P<0.05)。结论(1)体外高糖刺激可引起巨噬细胞分泌外泌体增加,(2)体外巨噬细胞源外泌体可被系膜细胞摄取,(3)系膜细胞摄取高糖-外泌体后可引起其增殖、活化、分泌细胞外基质和分泌炎症因子功能的改变,(4)TGF-β1 mRNA通过外泌体参与了巨噬细胞和系膜细胞间的联系,(5)TGF-β1 mRNA可能通过激活系膜细胞内的TGF-β1/Smad3通路引起了系膜细胞形态和功能的改变,(6)高糖刺激巨噬细胞源外泌体在小鼠体内可以引起肾脏系膜区的纤维化改变及TGF-β1/Smad3通路激活。