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背景和目的：超过90%的恶性肿瘤患者会出现肿瘤转移现象，而且其中超过90%的死因与肿瘤转移有关。骨骼系统是肿瘤患者体内瘤细胞的常发转移部位。前列腺癌和乳腺癌是转移性肿瘤的常见病因。此外，其他类型肿瘤如肺癌、肾脏及甲状腺肿瘤也会发生骨转移。晚期肿瘤转移至骨将会引起一些严重的并发症，比如严重的骨痛，通常这类疼痛对治疗不敏感，还有脊髓压迫、病理性骨折和高钙血症。前列腺癌患者多死于肿瘤转移性骨疾病(Metastatic bone disease, MBD)，这类疾病通过放射显影技术观察通常会表现出明显的对骨组织呈成骨性，而非溶骨性的破坏。这通常是由于前列腺癌细胞侵入至骨髓微环境，影响了骨形成和骨吸收的平衡，且介导了成骨细胞的过度活化所造成的。大量的研究发现，骨转移后的前列腺癌细胞通过分泌促成骨性因子刺激成骨前体细胞活化。WNT信号因子、转化生长因子-β(TGF-β)以及骨形态发生蛋白等信号蛋白能够促进各种成骨前体细胞，如MC3T3-E1(鼠源性前体成骨细胞亚克隆系)细胞以及骨髓间充质干细胞(BMSC)向成熟成骨细胞分化。WNT信号蛋白是一种糖脂类信号分子，通过目标细胞内的信号转导蛋白β-catenin发挥促进成骨成熟的作用。β-catenin最早发现其参与α-catenin以及cadherin的黏着连接，但此后因作为WNTs的信号转导共活化因子而被广泛熟知。经典WNT配体通过与其受体复合物，包括FZD蛋白家族的七次跨膜受体以及LRP5或LRP6，激活WNT/β-catenin信号通路，来自WNTs的信号能够抑制β-catenin的降解，保证后者呈稳定状态，并能够转位至胞核与TCF/LEF蛋白结合，进而激活WNTs目标基因的转录。此外，WNT配体还能够促进成骨细胞中BMP2的表达，后者被证明同样对成骨分化有重要的促进作用。由此可见WNT/β-catenin对成骨分化起到关键的调节作用。但前列腺癌细胞通过分泌何种促成骨因子进而调节WNT/β-catenin通路参与促成骨作用的相关机制研究并不透彻。近期有研究发现，Semaphorins家族中Semaphorin3A(Sema3A)，能够刺激成骨性的骨矿化，表现出明显的骨保护特性，其生物学功能的发挥是依靠与其特异性受体NRP1连接而实现的。但目前仍然缺乏前列腺癌细胞是否通过分泌Sema3A介导成骨细胞内WNT/β-catenin通路进而促进成骨分化的相关研究。研究方法：我们观察不同前列腺癌细胞对成骨前体细胞MC3T3-E1成骨分化的影响，为后续机制学研究建立前列腺癌与成骨前体细胞共培养模型，并检测各型前列腺细胞系中Sema3A表达的差异。而后，我们着重研究前列腺癌细胞C4-2是否能够分泌Sema3A参与促成骨分化的机制。最后，我们检测前列腺癌细胞来源的Sema3A对成骨前体细胞内WNT/β-catenin信号通路，重点是对β-catenin活化的影响。一、体外共培养模型的建立以及各型前列腺癌细胞系中Sema3Ａ的表达差异1.收集各前列腺癌细胞系的条件培养基(CM)，分组，分别刺激成骨前体细胞MC3T3-E1在成骨诱导培养基中分化。分别于实验第3天收集各实验组细胞测定碱性磷酸酶(ALP)活性，并做ALP染色，第14或第21天利用茜素红染色观察实验细胞矿化成熟程度；并在实验第14天利用qPCR技术检测各实验组细胞成骨相关标志性基因Col1α1, OCN和RUNX2/Cbfa1mRNA的相对表达量。2.利用Western-blot蛋白印迹分析以及细胞免疫荧光共聚焦显微镜观察各型前列腺癌细胞系中Sema3A的表达差异。二、Sema3A/NRP1在前列腺癌介导的促成骨分化中作用机制的研究利用携带干扰Sema3A表达shRNA的慢病毒转染前列腺癌细胞系C4-2(该细胞系在前述实验中被证明能够明显促进成骨分化)，或Sema3A特异性中和抗体处理其CM，制备如下4种条件培养基：C4-2成骨条件培养基、C4-2-Sema3A成骨条件培养基、C4-2NC成骨条件培养基、成骨诱导培养基，或另外4种：C4-2成骨条件培养基, C4-2Sema3A Ab成骨条件培养基, C4-2IgG成骨条件培养基和成骨诱导培养基。进过共培养3天或14天，收集实验细胞，进行如下实验：1.利用ALP活性检测和BCIP/NBT染色法检测各组细胞ALP活性。2.利用茜素红S染色检测各种细胞骨结节矿化形成情况。3.利用qPCR技术检测各组细胞Col1α1, OCN和RUNX2/Cbfa1mRNA的相对表达量。4.利用Western-blot蛋白印迹法检测实验细胞表面Sema3A特异性受体NRP1的表达，以及细胞质中活性状态的β-catenin的表达差异。实验结果：一、体外共培养模型的鉴定1. C4-2细胞和LNCaP细胞条件培养基能够显著促进成骨前体细胞MC3T3-E1中ALP的活化以及矿化形成程度(P<0.05)。相反PC-3细胞条件培养基对上述过程却呈抑制作用(P<0.05)。2.含C4-2细胞条件培养基(20%，v/v)的成骨诱导培养基能够明显促进MC3T3-E1细胞分化过程中成骨相关标志基因Col1α1, OCN和RUNX2/Cbfa1mRNA的相对表达量(P<0.05)。二、Sema3A的表达1.细胞免疫荧光检测：使用Sema3A的特异性一抗以及标记FITC荧光素的二抗探针检测各型前列腺癌细胞系中的Sema3A，其中C4-2细胞中指示Sema3A表达的绿色荧光最明显。2. Western-blot蛋白印迹法：抽提各型前列腺癌细胞系的总蛋白，并利用Sema3A特异性抗体检测其表达。其中，C4-2细胞中Sema3A蛋白印迹灰度值最高。三、Sema3A/NRP1在前列腺癌介导的促成骨分化中作用机制的研究1.成骨分化：1)碱性磷酸酶的活性：与阳性对照组相比，C4-2条件培养基处理过后MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶活性明显增强(P<0.05)，但在使用慢病毒静默Sema3A在C4-2细胞中表达，或是使用中和抗体下调Sema3A在C4-2细胞条件培养基中含量后，其与正常对照相比，无显著差异。2)矿化实验：使用shRNA-Sema3A或是Sema3A中和抗体后，先前因使用C4-2细胞条件培养基促进而大量形成的骨钙化结节又明显减少，而且骨钙化面积也明显缩小(P<0.05)。3)成骨相关基因表达：C4-2细胞条件培养基可促进成骨分化相关基因Col1α1,OCN和RUNX2/Cbfa1mRNA高表达(P<0.05)，但使用shRNA-Sema3A或是Sema3A中和抗体后，上述成骨相关基因mRNA相对表达量与阳性对照组相比无明显差异。2.特异性受体NRP1在成骨细胞表面的表达：使用shRNA-Sema3A或是Sema3A中和抗体后，NRP1在MC3T3-E1表面表达量明显降低(P<0.05)。3. MC3T3-E1细胞质内β-catenin的活化检测：成骨细胞质内β-catenin的活化受C4-2细胞条件培养基影响，在共培养0h、48h及96h后利用Wester-blot法检测蛋白表达，发现β-catenin的活化呈时间依赖性增强，与刺激时间呈正相关(P<0.05)。使用shRNA-Sema3A或是Sema3A中和抗体后，在成骨诱导过程中MC3T3-E1细胞质中稳定活化状态的β-catenin表达量明显减少(P<0.05)。结论：一、Sema3A在高转移性的、具有明显促成骨活性的前列腺癌细胞系中高表达。二、Sema3A参与前列腺癌细胞系介导的促成骨分化过程，其表达与前列腺癌细胞系促成骨活性呈正相关。三、成骨前体细胞中β-catenin通路的激活受前列腺癌所表达的Sema3A信号分子的影响，暗示前列腺癌细胞系可能通过表达Sema3A，调控成骨前体细胞中β-catenin信号通路，进而促进成骨前体细胞的分化成熟。