格氏沙雷菌的群体感应现象与对其AHLs抑制作用的研究

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(1)从腐败的大菱鲆中分离得到一株具有群体感应现象的菌株,根据生理生化鉴定及16S rRNA鉴定,确定其为格氏沙雷菌(Serratia grimeii),命名为Serratia grimeii SG-05。采用微生物传感菌琼脂扩散法对菌株SG-05群体感应进行检测,结合GC-MS分析方法,进一步鉴定格氏沙雷菌产AHLs信号分子的类型。结果表明,菌株SG-05能够诱导紫色杆菌CV026(Chromobacterium violaceum CV026)和根瘤农杆菌A136(Agrobacterium tumefaciens A136)分别发生颜色变化。通过GC-MS法,可知格氏沙雷菌至少能够分泌两种信号分子,分别为C6-HSL和C8-HSL。(2)采用平板报告法,探究其生长阶段N-酰基高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactone,AHLs)分泌规律,并探讨NaCl浓度(0%、0.5%、1.0%、1.5%,2.0%、3.0%和4.0%)、碳源(果糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、甘露醇、乳糖和鼠李糖)、氮源(NH4Cl、胰蛋白胨、酵母浸粉、牛肉浸粉和脲素)和起始pH(5、6、7、8、9)对其AHLs产生的影响。结果表明,随着培养时间的延长,菌株SG-05培养液pH逐渐升高,AHLs分泌量表现出先升高后降低的趋势,呈密度依赖性;随着氯化钠浓度的增加,格氏沙雷菌产AHLs能力呈先增加后降低的趋势。当氯化钠浓度在0.25%-1.5%时,该菌信号分子产量最高,当浓度大于2%时,AHLs产量明显较少。在不同碳源(葡萄糖、果糖、木糖、麦芽糖等)培养基中生长,均促进菌株SG-05分泌AHLs,当以果糖为碳源时AHLs分泌量最大;在以胰蛋白胨为氮源时,细菌的菌液密度和紫色圈变色直径达到最大值;同时发现弱酸或中性环境适合菌株SG-05分泌AHLs,其中pH为6.0时AHLs分泌量达到最大值。研究证实格氏沙雷菌AHLs的分泌受到菌液密度和外界环境因素的共同调控。(3)研究添加外源信号分子标品对格氏沙雷菌生物被膜的影响。通过脱脂牛奶平板法,研究格氏沙雷菌SG-05胞外蛋白水解酶产生的情况,同时将格氏沙雷菌SG-05接种到大菱鲆肌原纤维蛋白和肌浆蛋白提取物中,采用SDS-PAGE法,探讨格氏沙雷菌SG-05及其AHLs对肌肉蛋白的降解作用,最后对比添加外源信号分子标品,测定格氏沙雷菌接种无菌鱼汁中感官评定、菌落总数、TBA及色差的变化来研究群体感应对格氏沙雷菌体内致腐能力的调控作用。结果表明,添加外源信号分子明显该菌株生物被膜的形成,尤其添加C6-HSL在36h时生物被膜形成量达到最大值。外源信号分子格氏沙雷菌SG-05能够分泌胞外蛋白酶,且随C4-HSL添加量的增加其蛋白水解酶活性明显增加;格氏沙雷菌SG-05可以促进肌原纤维蛋白与肌浆蛋白提取物的降解,且外源信号分子标品对格氏沙雷菌降解肌浆蛋白能力有明显促进作用,与C4-HSL添加量呈正相关;格氏沙雷菌对无菌鱼汁有致腐能力,且添加C4-HSL可以加快鱼汁的腐败速率,说明群体感应能够调控格氏沙雷菌的体内致腐能力。(4)β-环糊精因其特殊分子洞结构,可以包埋群体感应信号分子,能够有效抑制CV026的群体感应现象。同时对格氏沙雷菌生物被膜的形成和分泌嗜铁素能力有明显的抑制作用。经β-环糊精与葡萄籽提取物复配保鲜的大菱鲆鱼块腐败速率缓慢,菌落总数,T-VBN和pH均显著低于单一保鲜组及空白对照组,且在贮藏过程中,持水能力优于其他组,说明两者复配具有协同抑制格氏沙雷菌及其他腐败菌的腐败能力,在水产品保鲜方面具有广阔的利用前景。
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