目前,L-哌啶甲酸产生菌主要通过代谢工程育种获得,策略集中于利用质粒系统对原有途径进行改造或者构建新的途径。但其存在很多潜在问题,如质粒系统传代过程中的不稳定性、抗性的添加。另外,单方面的加强或者削弱基因的表达,会对菌体的能量流和代谢流产生影响,引发菌体自身的调控,不利于目的产物的积累。因此,本论文对赖氨酸浓度采用动态调控的策略,并将基因编辑技术CRISPR-Cas9和化学染色体进化技术（chemically inducible chromosomal evolution,CICh E）结合,实现了目的基因在基因组上的多拷贝插入。该策略为代谢工程的改造提供了新思路,可应用于其他生物合成途径。主要研究结果如下:（1）选择最佳的L-哌啶甲酸生产途径。以高产L-赖氨酸的Escherichia coli XQ-11为出发菌株,分别构建L-赖氨酸-6-氨基转移酶途径（L-lysine-6-aminotransferase pathway,LAT）、L-赖氨酸环化脱氨酶途径（L-lysine cyclodeaminase pathway,LCD）和L-赖氨酸-6-脱氢酶途径（L-lysine-6-dehydrogenase pathway,lys DH）,并验证其在XQ-11中的生产性能。实验结果发现,3个重组菌株产量相差不大,但LCD途径具有更大的生产潜力,其重组菌株E.coli XQ-11-1的L-哌啶甲酸产量为28±1.7 g·L-1。因此,选择LCD途径进行进一步研究。（2）动态调控胞内L-赖氨酸浓度。对于LCD途径来说,充足的L-赖氨酸是L-哌啶甲酸稳定、持续生产的关键。本文引入抑制型赖氨酸核糖体开关来动态调控L-赖氨酸转运蛋白Lys P的表达。通过随机突变的方法获得了激活型核糖体开关,并用于L-赖氨酸外排蛋白Lys O的表达,进一步构建了调控L-赖氨酸浓度的双基因通路。该策略能够加强赖氨酸分子在细胞膜两侧的流通,从而维持胞内的L-赖氨酸浓度处在一个合适的范围内,既可以提供充足的底物,又不会触发反馈抑制。最终,获得重组菌株E.coli XQ-11-3,其L-哌啶甲酸产量为51±5.7 g·L-1。（3）选择合适的基因组插入位点。基因组位点具有多样性和复杂性,而且很多功能区域尚没有进行研究。插入位点的不同会导致外源基因的表达相差甚大。本文利用Tn5转座反应将pipA基因随机插入基因组,并借助先富集后筛选的策略获得转化子。通过对产量测定和插入位点序列的分析,选择exb D基因座为最适合LCD途径插入的位点。（4）实现LCD途径在基因组的多拷贝插入。本文利用CRISPR-Cas9技术将LCD途径定点插入到exb D基因座。之后,在胞内重组酶的作用下,利用化学染色体进化技术,实现LCD途径的多拷贝。最终,获得拷贝数为25的重组菌株E.coli XQ-11-4,其产量为61±3.4 g·L-1,生产速率为1.02±0.06 g·L-1·h-1。另外,与具有质粒系统的菌株相比,CICh E菌株具有稳定的生产力,且后期培养无需添加抗性。