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鸡球虫病是由一种或多种艾美尔球虫感染鸡肠道细胞而引起的一类原虫疾病。艾美尔球虫的生活史极其复杂,其不仅会掠夺肠道中的营养而且会对肠道细胞造成不同程度的损伤。当前,鸡球虫病防控仍以药物为主,但长时间的使用药物使得耐药虫株不断出现,因此,球虫耐药性问题越演越烈。多年来,研究者们试图通过其他途径来解决这一问题,主要包括优化使用抗球虫药物、新型抗球虫药物的筛选以及制备新型抗球虫疫苗。虽然球虫药物筛选和新型抗球虫疫苗制作的方法早已报道,但球虫体外培养技术仍没有完全建立和虫株之间的交叉保护力较低导致抗球虫药物筛选和抗球虫疫苗研发进展缓慢。因此,本研究从找寻理想保护性抗原的角度出发,克隆了E.tenella在入侵和生长发育中扮演重要作用的表面抗原家族基因EtSAG4、EtSAG16和EtSAG22,将3个基因分别和共同插入到原核表达载体pET28a和真核表达载体pEGFP-N1之中。在此基础之上进行了动物实验,旨在评价实验动物免疫重组蛋白或重组质粒后抗E.tenella感染的保护效果。研究主要包括以下几个方面:(1)E.tenella野生株的分离和遗传多态性分析从湖北省分离获得的8个地区鸡球虫卵囊孢子化后接种鸡,从其盲肠中收集球虫卵囊,通过形态学和ITS1鉴定方法获取了21个E.tenella野生株。ITS1序列进化分析发现各地区E.tenella野生株高度保守,ITS1序列的同源比率从92.7%至100%不等。地理分布的4个地区虫株ITS1序列与其他国家的原虫进化分析表明野生株同样与其他国家的虫株具有保守性。市区分布的9个区域虫株RAPD分析表明所分离的虫株遗传特点呈局部地区关联性和跨地域交叉关联性。(2)E.tenalla表面抗原基因EtSAG4、EtSAG16和EtSAG22克隆及分析从分离的E.tenalla随州1株的cDNA中成功地扩增到了3个基因的全长序列,与E.tenalla毫顿株的序列比对结果表明三者与豪顿株均具有100%的序列同源性。生物信息学分析发现3个抗原氨基酸序列的N末端含有信号肽和C末端含有GPI锚定结构域,且这两个结构域的亲水性较低。(3)EtSAG4、EtSAG16、EtSAG22和EtSAG41622的原核表达分别从3个基因全长序列中扩增了去信号肽和GPI锚定结构域的截短序列,将单个基因或3个基因的截短序列构建到原核表达载体pET28a中。在28℃环境下诱导10 h表达了重组蛋白EtSAG4、EtSAG16、EtSAG41622,在37℃环境下诱导5 h表达了重组蛋白EtSAG22。Western blot结果显示4个重组蛋白能与His标签抗体和感染了E.tenella 15天鸡的血清产生反应,结果证明这4个重组蛋白成功表达。(4)EtSAG4、EtSAG16、EtSAG22和EtSAG41622的真核表达将3个基因去信号肽和GPI锚定结构域的截短序列分别或共同构建到真核表达载体pEGFP-N1中。通过脂质体转染方法将4个质粒转染到293T细胞中,荧光显微镜观察结果显示转染了重组质粒的细胞均能发出绿荧光,但转染空质粒pEGFP-N1的细胞也能发出绿荧光,无法完全证明重组质粒转染成功。RT-PCR的结果显示以转染了重组质粒的细胞cDNA为模板可扩增出4个插入片段的目的条带,以转染了pEGFP-N1质粒细胞cDNA为模板和阴性对照却未能扩增出片段;Western blot实验结果显示转染了重组质粒的细胞蛋白可与GFP标签抗体产生反应,而阴性对照未能与GFP标签抗体产生反应,通过RT-PCR和Western blot实验证明了重组质粒在293T细胞中成功表达。(5)EtSAG4、EtSAG16、EtSAG22和EtSAG41622的免疫保护效果评估本研究对实验肉鸡进行了E.tenella感染的免疫保护效果评估,免疫重组蛋白动物实验设10组,免疫重组质粒动物实验设11组。除对照组外各实验组动物于14日龄免疫不同剂量(50μg或100μg)的重组原核表达蛋白或重组真核表达质粒,于21日龄进行二免,二免1周后每羽实验动物经口感染孢子化E.tenella卵囊5×104个(不感染不免疫组除外)。实验以检测二免后实验动物的细胞因子水平、IgY浓度和统计抗球虫指数相关数据,从而综合评价实验动物的免疫保护效果。免疫重组蛋白动物实验结果显示:免疫重组蛋白组与感染不免疫组的IFN-γ浓度均呈显著性差异;免疫重组蛋白EtSAG22(100μg)、EtSAG16(100μg)和EtSAG41622(100μg)剂量组与感染不免疫组的IL-17浓度均呈显著性差异;免疫重组蛋白EtSAG16(100μg)和EtSAG41622(100μg)剂量组与感染不免疫对照组之间的IgY浓度在统计学上具有差异性;以上结果说明免疫不同剂量重组蛋白后均能刺激机体产生IFN-γ水平的能力。ACI结果显示,3个免疫重组蛋白实验组的ACI达到了160以上,分别是免疫蛋白EtSAG4(100μg)组的163.77,EtSAG16(100μg)组的166.78和EtSAG41622(100μg)组的165.63,说明免疫这3个剂量蛋白的实验组具有中度抗E.tenalla感染的能力。免疫重组质粒动物实验结果显示:免疫重组质粒组与感染不免疫组的IFN-γ和IL-17浓度均呈显著性差异;免疫重组质粒7个剂量组与感染不免疫组的IgY浓度在统计学上具有显著性差异;以上结果说明免疫不同剂量重组质粒后均能刺激机体产生IFN-γ和IL-17水平的能力。ACI结果显示,6个免疫重组质粒组的ACI达到了160以上,其中以免疫重组质粒EtSAG41622(100μg)组的173.11最高,EtSAG41622(100μg)组的168.91次之,EtSAG22(100μg)组的168.28第三,结果表明免疫这6个剂量的重组质粒实验组具有抗E.tenalla感染的保护效果。