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本研究以半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)的甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶MASP1基因(CsMASP1)、甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶MASP2基因(CsMASP2)和胶原凝集素Collectin 11基因(CsCL-11)为研究对象,通过基因克隆,基因表达分析,原核表达及重组蛋白抑菌功能的验证等,获得以下结果:CsMASP1基因的cDNA全长2507 bp,5′非编码区长82 bp,3′非编码区长142 bp,开放阅读框长2283 bp,共编码760个氨基酸。预测其分子量为84.95 kDa,理论等电点(pI)为5.33。SMART结构域预测分析得知CsMASP1蛋白含有6个结构域:分别是2个类Clr/Cls蛋白结构域(like Clr/Cls Protein domain,CUB)(47-168aa,215-327aa),1个表皮细胞生长因子样结构域(calcium-binding epidermal growth factor-like domain,EGF-CA)(169-212aa),2个补体控制蛋白区结构域(complement control protein domain,CCP)(331-392aa,397-461aa)和1个丝氨酸蛋白激酶区Tryp-SPc结构域(serine protease domain,SP)(478-752aa)。CsMASP1含有13个外显子,位于4号染色体上;同源性比对发现CsMASP1与金目鲈的相似性最高,为76%;而与中国仓鼠的相似性最低,为42%。CsMASP1在11种健康组织(血液、脑、鳃、性腺、心脏、头肾、肠、肝、皮肤、脾和后肾)均有不同程度的表达,在肝中相对表达量最高(185.4)。鳗弧菌(Vibro anguillarum)感染半滑舌鳎后,CsMASP1基因在6种免疫组织(血液、鳃、头肾、肠、肝和脾)中呈现明显的上调表达,其中脾和肝中的上调表达趋势最明显,在脾中的相对表达量为15.4,在肝中的相对表达量为12.4。CsMASP2基因的cDNA全长1457 bp,包含136 bp 5′非编码区、406 bp 3′非编码区和915 bp开放阅读框,编码304个氨基酸。预测其分子量为34.4 kDa,理论等电点(pI)为5.83。SMART结构域预测分析得知CsMASP2蛋白前18个氨基酸残基为信号肽,18~136和183~294位氨基酸残基为两个CUB结构域,137~180位氨基酸残基为EGF-CA结构域。CsMASP2含有6个外显子,位于10号染色体上;同源性比对比对发现CsMASP2与鲈亚目鱼类尖吻鲈MASP2相似性较高,为79.28%。CsMASP2在11种健康组织(同上)均有不同程度的表达,肝脏中表达量最高(230.4)。鳗弧菌感染半滑舌鳎后,CsMASP2在6种免疫组织(同上)中均呈上调表达趋势,在头肾和脾脏中上调表达最明显,在头肾中的相对表达量为11.7,在脾脏中的相对表达量为17.0。构建原核表达载体pET-32a-CsMASP2进行蛋白诱导表达,重组蛋白抑菌功能分析rCsMASP2对鳗弧菌(V.anguillarum)、副溶血性弧菌(V.Parahemolyticus)、爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)、希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)、大肠杆菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)都具有良好的抑菌效果,对副溶血弧菌抑菌效果最为显著,当浓度为0.01mg/mL时,抑菌率为35.6%;浓度为0.05mg/mL时,抑菌率高达87.9%。表明CsMASP2在鱼类机体免疫应答过程中发挥重要作用。CsCL-11基因的cDNA全长1314 bp,包含199 bp 5′非编码区、275 bp 3′非编码区和840 bp开放阅读框,编码279个氨基酸。预测其分子量为34.4 kDa,理论等电点(pI)为5.33。SMART结构域预测分析得知CsCL-11蛋白包含一个Collagen结构域(55-114aa)和一个CLECT结构域(159-274 aa)。CsCL-11含有7个外显子,位于1号染色体上;同源性比对比对发现CsCL-11与尖吻鲈CL-11的相似度最高,为86.4%。CsCL-11在11种健康组织(同上)均有不同程度的表达,卵巢中表达量最高(12000)。鳗弧菌感染半滑舌鳎后,CsCL-11在6种免疫组织(同上)中均呈上调表达趋势,在肝脏和肠中上调表达最明显,在肝脏中的相对表达量为25.5,在肠中的相对表达量为25.3。构建原核表达载体pET-22b-CsCL-11进行蛋白诱导表达,重组蛋白抑菌功能分析rCsCL-11具有广谱的抗菌作用,对鳗弧菌、副溶血弧菌、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都具有良好的抑菌效果,其中对副溶血弧菌抑菌效果最为显著,当浓度为0.01mg/mL时,抑菌率为51%;rCsCL-11浓度为0.05mg/mL时,抑菌率高达96%。表明CsCL-11基因参与了半滑舌鳎的免疫应答过程。综上所述,以上实验结果表明半滑舌鳎CsMASP1基因,CsMASP2基因和CsCL-11基因在半滑舌鳎机体免疫应答中发挥着重要作用,本文为半滑舌鳎补体凝集素途径相关基因的研究奠定了理论基础。