论文部分内容阅读
氟和砷都是广泛存在于环境中的有毒物质,二者会对人和动物机体的多种脏器产生损伤,尤其是肾脏。自噬是一种蛋白降解系统,在肾损伤后近端小管功能的恢复和正常发挥重要作用。为了深入探究氟、砷对肾脏的影响,本实验采用健康小鼠作为研究对象,通过建立氟、砷模型,研究自噬相关通路与复合物的基因和蛋白表达的影响及其调控作用。本实验的研究结果将为深入研究氟、砷及其联合作用对仔代的影响,以及筛选人和动物氟、砷中毒的自噬相关指标提供理论依据。【实验方法】本次实验通过母鼠饮用水暴露氟、砷及其联合建立了动物模型,分组为:对照组（去离子水）、砷处理组（15 mg/L As2O3（Ⅲ））、氟处理组（100 mg/L Na F）以及氟砷联合（15 mg/L As2O3（Ⅲ）+100mg/LNa F）。仔鼠出生三周后断乳处死,取肾脏组织进行后续实验。采用HE染色观察肾脏病理变化;双重免疫荧光检测自噬相关基因LC3、LAMP1的定位及表达情况;通过Real-time PCR和Western Blot方法检测自噬相关因子m TOR,Beclin1,LC3,Bcl2,LAMP1和p62的m RNA及蛋白表达水平变化,以及相关m TOR通路和Beclin1复合物相关Atg基因的m RNA表达水平变化。【实验结果】1.仔代小鼠肾脏脏器系数结果显示:与对照组相比,氟处理组、砷处理组与氟砷联合组肾脏脏器比均显著升高（p<0.05）。2.HE染色结果显示:与对照组相比,砷处理组（As）可明显观察到肾小管壁变薄;氟（F）组中可以明显观察到肾小囊腔与肾小体之间的间隙变大;氟砷联合（F+As）组中,部分肾小管管壁变薄,肾小囊腔、肾小体变化不明显。3.免疫荧光结果显示,绿光LC3与红光LAMP1以及自噬-溶酶体数量在氟处理组荧光表达量与对照组相比显著升高,砷处理组、氟砷联合组与对照组相比无显著差异。4.RT-PCR结果显示:LC3,LC3-I,LC3-II,Beclin1,ULK1,p62,Atg3,Atg5,Atg13,Atg14,Caspase3在氟处理组m RNA表达量均显著升高（p<0.05,p<0.01）;LC3-II,Beclin1,Atg5,Caspase3,ULK1在砷处理组m RNA表达量均显著升高（p<0.05,p<0.01）;ULK1,Atg13,Atg14在氟处理组的表达与砷处理组相比差异显著升高（p<0.05,p<0.01）。ULK1,p62,Atg3,Atg14,Caspase3,Atg13在氟处理组的m RNA表达量与氟砷联合组相比显著升高（p<0.05,p<0.01）。m TOR,Bcl2在氟处理组与砷处理组m RNA表达量与对照组相比显著降低（p<0.05,p<0.01）,氟砷联合组结果与对照组相比无显著差异。5.Western Blot结果显示:LC3-II/LC3-I、Beclin1、p62、LAMP1在氟处理组蛋白表达量与对照组相比显著升高（p<0.05,p<0.01）;LC3-II/LC3-I、Beclin1蛋白表达量在砷处理组与对照组相比显著升高（p<0.05,p<0.01）,氟砷联合组与对照组相比无显著差异。m TOR、Bcl2蛋白表达量在氟处理组和砷处理组显著降低（p<0.05,p<0.01）,氟砷联合组与对照组相比无显著变化。【结论】本次实验结果显示:母鼠单独氟、砷暴露下,自噬相关因子的m RNA和蛋白表达量显著改变,氟砷联合组与对照组相比均无显著差异,说明本实验中所选取的氟、砷相关浓度导致氟、砷之间发生了拮抗作用。氟、砷单独暴露下诱导仔代小鼠自噬体的形成,m TOR和Beclin1复合物相关因子在自噬形成过程中起关键作用。同时,p62的升高,说明氟、砷抑制了自噬体在细胞内的降解。氟、砷导致的自噬体过度堆积对小鼠机体产生了毒害作用,这可能是氟、砷对肾脏毒性的一种体现。