研究背景与目的帕金森病(Parkinson’s Disease,PD)是一种常见的中枢神经系统退行性疾病,其多发病于65岁以上老年人群。伴随老龄人口的增加,全球PD患病率、发病率等呈上升趋势。我国正处于PD患病人数急剧增加的阶段,在目前和今后一段时间内PD患病人数将占全球患病人数的半数左右。作为一种低致死率、高病残率的疾病,PD不仅严重威胁着患者的身心健康,而且加重了家庭和社会负担。目前,PD的致病机理尚不清楚,亟待对其进行深入研究。PD疾病进程缓慢,在疾病发生的早期阶段主要出现嗅觉功能障碍、快速眼动睡眠行为障碍等非运动症状,随着病情的加重,一些典型的临床症状如静止性震颤、肌强直等会逐渐显现。目前,临床上对PD的评估和诊断主要依赖于其运动症状。值得关注的是,当PD患者被确诊时其脑内约30%~70%的黑质多巴胺能神经元已经缺失。因此,PD的早期诊断对延缓或早期干预PD的致病进程至关重要。为了实现精准的PD早期诊断,研究者把焦点关注于PD早期生物标志物研究。PD的主要病理特征为脑黑质致密部多巴胺能神经元的进行性缺失和路易小体(Lewy Bodies,LBs)及路易神经突(Lewy Neurites,LNs)的形成。其中,LBs和LNs主要由异常聚集的α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)组成。α-syn是一种由140个氨基酸组成的单体蛋白,其主要富集在突触前末梢。α-syn发生磷酸化等翻译后修饰能促进其由单体形式逐步向寡聚体、纤维结构发展,直至最终聚集形成LBs等沉积物,并严重破坏细胞的正常功能。研究发现,正常人脑内仅4%以下的α-syn在Ser129位点被磷酸化修饰,但在PD患者脑内形成的LBs中至少90%的α-syn在此位点被磷酸化,这也提示Ser129位点磷酸化的α-syn(P-α-syn)易于聚集,是PD的病理特征之一。在生理状况下,病理性的α-syn可被体内多种蛋白降解途径降解,如自噬-溶酶体途径和泛素-蛋白酶体系统。研究发现,当细胞内蛋白降解途径受损时其自身对异常α-syn的降解能力会受限,此时可能会激活其他非经典的分泌途径如外泌体相关的释放途径将异常的α-syn分泌到胞外环境。越来越多的证据表明外泌体不仅能促进α-syn的聚集,而且在神经细胞之间传播病理性的α-syn的过程中也能发挥一定的作用,从而加速PD疾病进程。外泌体是一种直径为30~150 nm的胞外膜性囊泡,在脑脊液、血液和尿液等体液中均存在外泌体。为了寻找有效的PD生物标志物,外泌体也被越来越多的研究者关注。目前,脑脊液、血液和尿液等体液成为备受关注的生物标志物的来源。一些研究结果表明:与正常对照组相比,PD患者组脑脊液中总的α-syn水平显著性降低,但寡聚的α-syn、P-α-syn和外泌体中的α-syn表达水平显著性升高;PD患者组血浆中分离出的中枢神经系统来源的外泌体中α-syn水平和Tau水平都显著高于健康对照组。此外,研究发现脑脊液中磷酸化的α-syn可能在PD发病机理及PD早期诊断中起到关键作用。这些研究结果提示血浆外泌体中α-syn和P-α-syn可能是PD的潜在生物标志物。本研究旨在利用Western Blot、质谱等技术检测α-syn和P-α-syn在PD患者和健康对照组血浆外泌体中的表达水平,寻找血浆外泌体中PD潜在的生物标志物,为PD的早期诊断提供理论依据,进而对提高诊断的准确性、获得良好的预后以及更早地获得潜在的疾病干预治疗等方面有重要的意义。本研究也探索了α-syn过表达是否对蛋白降解途径和囊泡释放途径造成影响,旨在初步探究PD的致病机制。材料与方法第一部分:血浆外泌体中α-syn和P-α-syn的检测1.收集健康对照者和PD患者血浆样本各36例,然后分别使用外泌体沉淀法和差速离心法分离出血浆外泌体。2.分别用透射电子显微镜、纳米颗粒追踪分析和Western Blot技术鉴定血浆外泌体的形态、粒径和表面标记蛋白。3.使用Western Blot技术检测血浆外泌体中α-syn和P-α-syn的蛋白酶K降解特性。4.使用Western Blot技术检测血浆外泌体中α-syn和P-α-syn表达水平,并使用质谱技术初步检测健康对照组和PD患者组血浆中蛋白的差异表达。第二部分:α-syn过表达对PC12细胞中蛋白降解系统的影响1.PC12细胞分别转染pc DNA3.1(-)质粒和编码SNCA的质粒,然后使用实时荧光定量PCR技术检测PC12细胞中自噬-溶酶体途径和泛素-蛋白酶体系统相关蛋白的m RNA水平。2.PC12细胞分别转染pc DNA3.1(-)质粒和编码SNCA的质粒,然后使用免疫荧光技术检测PC12细胞中自噬-溶酶体途径和泛素-蛋白酶体系统相关蛋白和磷酸化的α-syn聚集物的共定位情况。研究结果1.差速离心法和外泌体沉淀法均能从PD患者组和健康对照组血浆中提取到外泌体,并且部分血浆外泌体来源于中枢神经系统;与差速离心法相比,外泌体沉淀法的提取外泌体产量显著升高(P<0.05)。2.PD患者组和健康对照组血浆外泌体的膜表面和内部均存在α-syn和P-α-syn,并且PD患者组血浆外泌体中的α-syn和P-α-syn更难被蛋白酶K降解(P<0.05)。3.PD患者组血浆外泌体中α-syn单体(17 KDa)水平与总的α-syn水平的比率(α-syn单体/总α-syn)显著地低于健康对照组(P<0.05);α-syn寡聚体(26~42 KDa)与总的α-syn的比率(α-syn寡聚体/总α-syn)显著地高于健康对照组(P<0.05)。4.PD患者组血浆外泌体中P-α-syn寡聚体与总的P-α-syn的比率(P-α-syn寡聚体/总P-α-syn)显著地高于健康对照组(P<0.05)。5.PD患者组血浆中分离出的中枢神经系统来源的外泌体中相对的α-syn寡聚体和P-α-syn寡聚体表达水平都高于健康对照组,但无显著性差异(P>0.05)。6.PD患者组和健康对照组血浆外泌体中α-syn寡聚体/总α-syn的受试者工作特征(Receiver Operating Characteristic,ROC)曲线分析性能是中度的(AUC=0.7054,敏感性=60.5%,特异性=59.4%),P-α-syn寡聚体/总P-α-syn的ROC分析性能也是中度的(AUC=0.6895,敏感性=60.0%,特异性=59.5%)。7.质谱技术能在PD患者血浆(n=4)中检测到α-syn的存在,在健康对照血浆(n=3)中暂未检测到α-syn的存在。8.与转染pc DNA3.1(-)质粒的PC12细胞相比,α-syn过表达PC12细胞中α-syn的m RNA水平显著升高(P<0.0001),自噬-溶酶体途径相关蛋白(LC3、ATG5、ATG16L2、LAMP2)和泛素-蛋白酶体系统中相关蛋白ubiquitin的m RNA水平有升高的趋势(P>0.05),自噬-溶酶体途径相关蛋白ATG12的m RNA水平显著升高(P<0.05),并且与PD病理学相关的UCH-L1的m RNA水平显著升高(P<0.001)。9.与pc DNA3.1(-)质粒组相比,α-syn过表达组中P-α-syn与LC3B共定位显著增多(P<0.05),与Ubiquitin的共定位无显著差异(P>0.05)。10.与转染pc DNA3.1(-)质粒的PC12细胞相比,α-syn过表达的PC12细胞中囊泡释放途径相关的蛋白CD63和RAB11A的m RNA水平显著升高(P<0.05)。结论:1.PD患者组血浆外泌体中的α-syn和P-α-syn聚集物比健康对照组更具有蛋白酶K难溶性,并且血浆外泌体中α-syn寡聚体/总α-syn和P-α-syn寡聚体/总P-α-syn水平的增加可能是PD潜在的生物标志,可用于疾病诊断。2.α-syn过表达的PC12细胞中自噬-溶酶体途径主要发挥清除α-syn的作用,并且PC12细胞中α-syn的过表达能引起外泌体和RAB11A相关的囊泡释放途径的激活。