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中性白细胞抑制因子（Neutrophil inhibitory factor,NIF）是一种犬的钩虫（Ancylostoma caninum）分泌的糖蛋白，理论分子量为41 kDa，其cDNA编码的蛋白质由274 个氨基酸残基组成，N端有17个氨基酸残基的信号肽，成熟蛋白有257个氨基酸残基。NIF是一种新型抗炎因子，它能专一地结合人中性白细胞膜上的整合素CD11b/CD18，从而抑制活化的中性白细胞释放H2O2以及粘附血管内皮细胞，以此减轻中性白细胞介导的组织损伤。目的：美国辉瑞公司将rNIF用于治疗与局部出血性中风相关的再灌注损伤，现已进入Ⅱ期临床。仅美国每年就大约有750 000人患上局部出血性中风，如果rNIF顺利通过临床实验，无疑具有极大的商业价值。在基因工程中，rNIF的表达一般采用真核表达系统，美国Corvas公司的Moyle等人就利用巴斯德毕赤酵母成功表达出rNIF，但尚未见利用原核表达系统表达rNIF的报道，本研究初步探讨了如何利用大肠杆菌表达rNIF并进行纯化。方法：根据有关文献报道的编码NIF成熟肽的cDNA序列并参照引物设计的基本原则，设计出一对引物，以含目的cDNA的质粒PUC57为模板，利用PCR技术扩增目的cDNA。用限制性内切酶NdeⅠ和BamHⅠ双酶切扩增产物和表达质粒pET-21a(+)，连接目的cDNA和表达质粒的大片段，将连接产物用CaCl2 法转化大肠杆菌DH5α。抽提重组质粒pET-21a(+)/NIF，用NdeⅠ和BamHⅠ小量双酶切，确定目的cDNA与表达质粒的大片段是否正确连接，然后由上海生工用Sanger双脱氧链终止法-PUC体系对目的cDNA测序，确定目的cDNA的基因序列是否正确。大量抽提重组质粒，转化宿主菌BL21（DE3）plysS，经IPTG诱导，确定rNIF在宿主菌BL21（DE3）plysS中以可溶形式或包涵体形式高效表达，通过发酵大量制备rNIF。离心分离表达菌体和培养基，收获的菌体用Tris-HCl 缓冲液（pH8.0）+超声破菌处理，再离心收集包涵体沉淀，经过洗涤、溶解和复性，rNIF复性溶液经Q-Sepharose层析、羟基磷灰石（HTP）层析、Sephacryl S-100凝胶过滤层析，得到纯化的rNIF。在纯化过程中，用Bradford法测定rNIF浓度。凝胶扫描15％SDS-PAGE胶条，测定rNIF在全菌蛋白中的百分含量。HPLC分析rNIF纯品的纯度。通过中性白细胞与96孔细胞培养板的粘附性实验，测定rNIF抑制中性白细胞粘附的活性。结果：本研究成功利用PCR技术扩增出目的cDNA并克隆于表达质粒pET-21a(+)。对目的cDNA的序列分析结果表明，扩增的目的cDNA序列与文献报道一致。经IPTG诱导3 h，rNIF在宿主菌BL21（DE3）plysS中以包涵体形式实现高效表达。凝胶扫描的分析结果表明，目的蛋白（28.9 kDa）约占全菌蛋白的20％。HPLC的分析结果表明，rNIF纯品的纯度在98％以上。活性测定结果表明，rNIF能有效抑制中性白细胞的粘附。结论：本研究在大肠杆菌中高效表达出具有生物活性的rNIF,而且摸索出一套相应的纯化工艺，该工艺成本低、工艺衔接合理、分离效率高，可以方便的放大至中试和生产规模,这些结果为利用大肠杆菌制备rNIF奠定了基础。