本论文分两部分,第一部分内容为新型荧光素酶NanoLuc的结构研究和改造。生物发光是指通过生物体产生和发射光,是化学发光的一种特殊形式,广泛存在于自然界中。近年来,由于其光检测灵敏、转化效率高、毒副作用小、易于使用等优点,受到了广大科研工作者的重视,越来越多的研究致力于开发新的生物发光系统并将其应用于基因工程和生物医学研究。生物发光的主要应用领域包括体内成像、细胞活力测定以及报告基因检测等,无论是在医疗检测还是实验室研究中均发挥着重要作用。目前,生物发光系统的研究主要集中于高稳定性荧光素酶的开发。NanoLuc(NLuc)是一种从深海虾Oplophorus gracilirostris中提取并经历三次诱变,经过筛选、优化而得到的荧光素酶,它的分子量为19.1 kDa,是目前已知最小的与光形成有关的蛋白质。NanoLuc通过氧化腔肠素的类似物furimazine产生荧光,不依赖于ATP,发光强度比萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶高大约150倍,信号半衰期大于2个小时,是当前最新的用于生物研究的荧光素酶。相较于生命科学领域目前常用的绿色荧光蛋白(GFP)系统,荧光素酶标记蛋白质不需要使用激发光以及考虑荧光猝灭、光漂白等在荧光蛋白系统中经常遇到的问题,有利于光敏感的生物系统研究;并且荧光素酶的分子量较小,对目的蛋白本身的结构影响较少,十分有利于生命科学领域的研究。本论文通过大肠杆菌表达系统过量表达带有His标签的NanoLuc蛋白,进而通过镍亲和层析和分子筛层析纯化蛋白质;纯化后的蛋白质进行结晶生长,得到的晶体由Argonne国家实验室Argonne Photon Synchrotron(APS,Chicago)LS-CAT光束源收集衍射数据;利用分子置换的方法得到了分辨率为2.36?的NanoLuc全长蛋白晶体结构。本研究显示NanoLuc结构是由11个反向平行的β折叠股形成的β桶状结构,其催化活性的中心即发色团位于β桶状结构的中心腔,在中心腔与底物furimazine结合并催化其氧化反应。论文进一步探究NanoLuc与底物共结晶的结构,以分析NanoLuc与底物的结合方式,为NanoLuc的应用提供了理论依据和科学思路;同时,由于NanoLuc的突变稳定性,通过突变三个甘基酸到丙氨酸获得的突变体NanoLuc具有较低的散发光背景,可以成为AlaRS引起的丙氨酸到甘氨酸错误翻译的检测工具。本文的第二部分对酪氨酸磷酸酶SHP2在结肠癌HCT-116细胞中的功能进行了研究。蛋白质酪氨酸磷酸化由蛋白质酪氨酸激酶(PTK)和磷酸酶(PTP)协同调控,酪氨酸磷酸化失调通常与癌症的发生发展密切相关。许多靶向PTK的抗癌药物在治疗各种癌症中已经发挥了重要的作用,目前,起负向调控作用的PTP也成为抗癌药物开发的潜在靶点。蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP2是PTP家族的成员之一,由原癌基因PTPN11编码。SHP2广泛表达于人体内,是生长因子、细胞因子和细胞粘附分子的受体,在多种细胞信号传导途径中均起到至关重要的作用,最具代表性的是Ras-Raf-MEK-ERK信号通路,它调节多种细胞生物学过程,包括生长、分化和增殖。SHP2是PTP家族唯一具有致癌作用的成员,它的功能获得性突变会导致多种癌症的发生,现已成为抗癌药物开发的热点。最近,科学家们筛选出了多种、高效专一的SHP2抑制剂,其中SHP099能够有效降低SHP2的异常活性,并且对PTK突变引起的癌症也有明显的抑制作用。不仅如此,SHP2在KRAS驱动的癌症中具有特殊的作用。我们以带有KRAS-G13D杂合突变的结直肠癌细胞系HCT-116为研究对象,结果发现,SHP2抑制剂并没有抑制HCT-116的生长,反而促进了细胞的生长和ERK1/2的活化。通过使用CRISPR技术建立SHP2基因敲除的HCT-116细胞系,进一步明确了SHP2的缺失对HCT-116细胞生长的促进作用。此外,将细胞植入免疫缺陷型小鼠时,SHP2基因敲除的HCT-116细胞肿瘤形成的能力显著增强。我们的研究表明,靶向SHP2会对某些特定癌症产生与预期相反的影响,说明SHP2在肿瘤生长中具有复杂的作用,这对靶向SHP2抗癌药物的深入开发和临床应用具有重要的指导意义。