论文部分内容阅读
目的:缺血性脑卒中是比较常见的慢性病之一,除了年龄以外,缺血性脑卒中的发生还与遗传因素、不良的生活习惯因素、合并其他慢性疾病(高血压、糖尿病、房颤、恶性肿瘤等)及环境因素等有关。研究显示气象因素中气温、气压、湿度、空气污染等与缺血性脑卒中发病存在相关性,短期内气温变化或极端天气可增加脑卒中发生及死亡的风险。不良的营养膳食也会增加缺血性脑卒中的患病风险,如高盐、高脂的饮食习惯,大量的饮酒以及维生素B12缺乏等。由于我国人口老龄化的不断加剧,疾病相关危险因素控制不佳及环境污染等因素,我国缺血性脑卒中的危害和造成的经济负担将进一步增加,因此针对于提高缺血性脑卒中治疗效果的研究就显得尤为重要。消旋-3-正丁基苯酞(Dl-3-n-Butylphthalide,NBP),通常简称作丁苯酞,来源于芹菜种子的提取物,是我国自主研制出来的一种治疗缺血性脑卒中的药物,具有多靶点的神经保护作用。尽管丁苯酞在中枢神经系统中对线粒体具有保护作用已得到证实,但其在缺血/再灌注诱导的神经细胞线粒体损伤中的具体作用机制尚未完全阐明。对内源性保护机制的探究有助于发掘缺血性脑卒中的预防和治疗策略。线粒体为细胞活动提供了动力,它们不仅以ATP的形式提供能量,也具有很多其他重要的细胞功能。线粒体功能障碍被认为是导致神经元死亡的缺血再灌注损伤的标志之一,维持线粒体的功能对于促进神经元存活至关重要。有研究发现细胞中的5’-单磷酸腺苷活化蛋白激酶(Adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)激活之后可以活化过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1(Peroxisome proliferator-activated receptorγcoactivator-1,PGC-1α),调节线粒体生物发生,补充受损的线粒体,增加线粒体的数量和呼吸功能,上调抗氧化防御系统。我们推测,丁苯酞可能通过激活AMPK信号调控线粒体生成起到对脑缺血/再灌注损伤的保护作用。为验证以上的推测:首先,我们采用C57BL/6J雄性小鼠建立了短暂性大脑中动脉栓塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,研究丁苯酞对小鼠缺血再灌注损伤诱导的神经细胞线粒体损伤的保护作用;然后,利用小鼠的原代皮质神经元糖氧剥夺/复糖复氧(Oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)模型,研究丁苯酞对OGD/R损伤的神经元线粒体生成的保护作用;最后,采用AMPK的靶向抑制剂化合物C(Compoud C,CC)来进一步验证AMPK信号在丁苯酞保护OGD/R神经元细胞线粒体生成障碍中的作用。研究方法:1、研究丁苯酞对小鼠缺血/再灌注损伤所诱导的神经细胞线粒体损伤的保护作用:将成年的雄性C57BL/6J小鼠随机分为4组:假手术组,假手术+NBP组,MCAO组以及MCAO+NBP组,按照实验设计进行筛选之后每组分别为18只。MCAO模型的小鼠均接受45min短暂性脑缺血和14d的再灌注处置。监测小鼠的神经功能评分等行为学指标、脑含水量、脑梗死体积、细胞凋亡情况、细胞ROS、线粒体ROS、线粒体膜电位、ATP生成量、线粒体生成情况等指标。2、研究丁苯酞对OGD/R损伤的神经元线粒体生成的保护作用:将原代皮质神经元随机分为5个组:对照组(培养液),100μM NBP组,OGD-R组,OGDR+50μM NBP组和OGD-R+100μM NBP组,NBP的处理时间为24h。首先用CCK8试剂检测OGD/R处理0h,1h,2h,3h,4h的神经元活力,确定实验条件为糖氧剥夺3h。然后,观察神经元的形态,其后检测原代皮质神经元的细胞凋亡情况,并评估其氧化应激及线粒体功能障碍的程度、线粒体生成情况等指标。3、研究AMPK信号在丁苯酞保护OGD/R神经元细胞线粒体生成障碍中的作用:将原代皮质神经元随机分为5个组:对照组(培养液),10μM CC组,OGDR组,OGD-R+100μM NBP组,OGD-R+100μM NBP+10μM CC组。其中糖氧剥夺时间为3h,复糖复氧时间为24h,100μM NBP处理时间为24h,CC预处理时间为1h。首先检测神经元的细胞活力,观察神经元形态,其后检测原代皮质神经元的细胞凋亡情况,并评估其氧化应激及线粒体功能障碍的程度,最后检测线粒体生成情况、AMPKα和PGC-1α的磷酸化水平等指标。结果:1、NBP可减轻小鼠脑缺血/再灌注损伤引起的神经功能损伤,激活AMPK并促进线粒体生成。与假手术组相比,MCAO组小鼠的神经功能评分降低,运动能力下降,双侧后肢压力差增高,旷场实验中总移动距离和平均速度下降,中心区的移动距离和停留时间减少,步态分析实验中的最大接触面积、足印长度、摆动速度、BOS和步周长指标均有下降,同时支撑时相比增加,初次和末次双支撑时相均有增加,细胞凋亡率增高,细胞ROS和线粒体ROS水平均增加,线粒体膜电位和ATP产生水平下降,PGC-1α、NRF1和TFAM因子的m RNA含量及蛋白表达水平下降,线粒体DNA拷贝数降低。而在NBP干预后,MCAO+NBP组较MCAO组的神经功能评分升高,运动能力提高,双侧后肢压力差均值降低,旷场实验中总移动距离和平均速度增高,在中心区的移动距离和停留时间增加,步态分析实验中的最大接触面积、足印长度、摆动速度、BOS和步周长指标上升,与此同时其支撑时相比降低,初次和末次双支撑时相均略降低,脑水肿、脑梗死体积及退行性变程度降低,凋亡率下降,细胞ROS和线粒体ROS水平下降,线粒体膜电位和ATP产生水平增高,PGC-1α、NRF1和TFAM因子的m RNA含量及蛋白表达水平增高,线粒体DNA拷贝数增高。单独给予丁苯酞对小鼠脑细胞上述指标没有影响。2、NBP可减轻原代皮质神经元OGD/R引起的细胞损伤,激活AMPK促进线粒体生成,且保护性作用与剂量有关。OGD-R组的细胞活力较对照组降低,细胞形态及网状结构受损,细胞凋亡率增高,Bax/Bcl-2比值和胞浆中Cyt-C表达量上升,细胞ROS和线粒体ROS水平增加,ATP生成水平及线粒体的膜电位下降,PGC-1α、NRF1、TFAM因子的m RNA含量及蛋白表达水平降低,线粒体DNA拷贝数减少,PGC-1α磷酸化水平下降;与OGD-R组相比,给予丁苯酞处理后减轻了原代皮质神经元因OGD/R引起的细胞活力下降,改善细胞形态及网状结构,减轻细胞凋亡率,使Bax/Bcl-2比值和胞浆中Cyt-C表达量下降,降低细胞ROS和线粒体ROS水平,提高ATP生成水平及线粒体的膜电位,使PGC-1α、NRF1和TFAM因子的m RNA含量及蛋白表达量增高,线粒体DNA拷贝数增高,使AMPK和PGC-1α磷酸化水平明显增高,并且这种保护作用与剂量相关,100μM NBP保护作用更强。单独给予丁苯酞对原代皮质神经元的上述指标没有影响。3、NBP可激活AMPK促进原代皮质神经元的线粒体生成,减轻因OGD/R引起的细胞损伤,加入AMPK靶向抑制剂后,这种保护作用被逆转。与OGD-R组相比,OGD-R+100μM NBP组的原代皮质神经元的细胞活性增高,细胞形态及网状结构受损减轻,细胞凋亡改变减轻,Bax/Bcl-2的蛋白表达量的比值降低,胞浆中Cyt-C含量减少,细胞中和线粒体中所产生的ROS量均降低,同时线粒体的ATP生成量及膜电位均增加,PGC-1α、NRF1和TFAM因子的m RNA含量及蛋白表达水平上升,线粒体DNA拷贝数增多,AMPK和PGC-1α磷酸化水平增高;加入10μM CC后,与OGD-R+100μM NBP组相比,原代皮质神经元的细胞活性下降,细胞数目减少且网状结构破坏加重,细胞凋亡率增高,Bax/Bcl-2比值和胞浆中Cyt-C表达量增加,细胞ROS和线粒体ROS水平升高,线粒体ATP生成水平及线粒体的膜电位下降,PGC-1α、NRF1和TFAM因子的m RNA含量及蛋白表达水平降低,线粒体DNA拷贝数减少,AMPK和PGC-1α磷酸化水平明显下降。单独给予10μM CC预处理对原代皮质神经元没有影响。结论:丁苯酞可以减轻缺血/再灌注损伤诱导的神经损伤和细胞凋亡,改善神经元网状结构。通过活化AMPK,上调缺血/再灌注损伤神经元的线粒体生成作用,丁苯酞可以减少细胞的氧化应激反应和线粒体功能障碍,对缺血/再灌注损伤具有保护性作用。