基于荧光信号放大的邻苯二甲酸二丁酯免疫检测方法

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邻苯二甲酸二丁酯(DBP)是食品包装材料中的一种增塑剂,它可能从食品包装材料中溶出进入食品,进而对人体健康造成危害。本论文以DBP为研究对象,构建了基于寡核苷酸链信号放大作用和基于碱性磷酸酯酶催化放大作用的两种DBP荧光免疫检测方法。首先,利用柠檬酸三钠还原法合成了粒径均一的金纳米粒子(Au NPs)。包被抗原(DBAP-BSA)通过静电吸附作用与Au NPs偶联,JOE荧光素修饰的寡核苷酸链(ss DNA-JOE)通过Au-S键与Au NPs偶联,制备了荧光探针(DBAP-BSA@Au NPs@ss DNA-JOE)。在检测体系中,Au NPs可以使JOE的荧光淬灭,当ss DNA-JOE与Au NPs距离接近,荧光信号发生淬灭。当加入二硫苏糖醇后,寡核苷酸链被从Au NPs上解离下来,二者距离变远,荧光信号恢复。本实验通过对DBAP-BSA和ss DNA-JOE偶联量以及偶联方法和偶联时间进行优化,最终制备出稳定高效的荧光探针。通过优化实验条件,最终确定抗体包被量为0.1μg/well,荧光探针稀释比例为1:20倍,样品稀释液为20%甲醇的PBS。在最佳条件下建立了基于寡核苷酸链信号放大的DBP荧光免疫检测方法,方法检测限为0.35μg/L。针对绿茶、食用油和白酒样品中DBP本底含量和添加量的检测,本方法的检测结果与气质联用方法(GC-MS)的测定结果具有很好的一致(R~2=0.9979)。其次,与DBP酶联免疫检测方法相结合,利用酶标二抗上的碱性磷酸酯酶可以分解4-氨基苯磷酸钠盐后与乙二胺溶液反应生成具有稳定性质的荧光聚合物碳点,构建DBP荧光检测方法。通过优化实验条件,最终确定抗原包被量为0.05μg/well,抗体稀释比例为1:4000倍,封闭液为1%的脱脂乳粉,酶标二抗稀释比例为1:10000,样品稀释液为20%甲醇的PBS。在最佳条件下建立了基于碱性磷酸酯酶催化放大作用的DBP荧光免疫检测方法,方法检测限为0.2μg/L。针对绿茶、食用油和白酒样品中DBP本底含量和添加量的检测,本方法的检测结果与GC-MS的测定结果具有很好的一致性(R~2=0.9997)。本研究中提及的两种信号放大作用都可以实现检测灵敏度的提高。基于寡核苷酸链信号放大的DBP荧光免疫检测方法灵敏度比使用相同抗原抗体的ELISA方法检测限提高38倍。基于碱性磷酸酯酶催化放大作用的DBP荧光免疫检测方法灵敏度比使用相同抗原抗体的ELISA方法检测限提高74倍。这两种检测信号放大手段可以为检测方法灵敏度提高提供新思路。
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