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第一部分神经干细胞的分离、培养、鉴定和基因转染实验一神经干细胞的分离、培养和鉴定目的:探讨从孕鼠胚胎脑泡中分离培养神经干细胞的方法,为神经干细胞的基础和应用研究提供可靠的神经干细胞来源。方法:取孕12 d的Wistar大鼠胚胎,无菌条件下取大脑皮质组织,利用无血清培养技术分离培养神经干细胞,血清诱导分化神经干细胞;细胞免疫组化法鉴定细胞。结果:成功由胚鼠分离培养出神经干细胞,其可传代培养,可分化成神经元和胶质细胞。结论:孕鼠胚胎脑组织中存在多潜能的神经干细胞,可作为实验研究的神经干细胞来源。实验二绿色荧光蛋白转染神经干细胞的研究目的:观察阳离子脂质体法转染增强型绿色荧光蛋白的效果,探讨NSCs作为基因靶细胞和EGFP示踪的可行性。方法:从孕12 d的Wistar大鼠胚胎脑泡培养神经干细胞,将报告基因pEGFP-N1经Lipofectamine介导转染神经干细胞(EGFP组)观察EGFP表达,以同期培养未转染的细胞作为对照组,测定细胞活力、生长曲线和转染效率。结果:荧光显微镜观察到被转染的神经干细胞长期表达绿色荧光蛋白,两组细胞具有相似的形态学变化和生长曲线,流式细胞仪结果显示转染率最高可达到15.2%。结论转染EGFP对胚胎神经干细胞的体外增殖无明显的影响;阳离子脂质体Lipofectamine介导转染神经干细胞效率较高,报告基因表达时间长,为进一步做标记细胞移植研究奠定了基础。实验三VEGF、EGFP共转染神经干细胞的研究目的:探讨VEGF共转染神经干细胞后,绿色荧光蛋白的表达、对神经干细胞的影响和VEGF表达情况。方法:从孕12 d的Wistar大鼠胚胎脑泡培养神经干细胞,将报告基因pEGFP-N1和VEGF经Lipofectamine介导转染神经干细胞,观察绿色荧光蛋白表达情况,神经干细胞经诱导后的突触生长情况和RT-PCR检测VEGF表达情况。结果:共转染后,仍可以在荧光显微镜下观察到带绿色荧光的NSCs;共转染的NSCs经诱导分化后,神经细胞的突起数目与细胞总数的比值均高于未转染的NSCs和EGFP-NSCs,经比较差异有显著性意义(P<0.05);RT-PCR示转染后VEGF的表达明显高于未转染的NSCs,经比较差异有显著性意义(P<0.05)。结论:共转染后,NSCs仍能稳定表达绿色荧光蛋白;VEGF有促进神经突起生长的作用,转染后的NSCs能够在mRNA水平表达VEGF。第二部分转基因神经干细胞移植治疗急性脊髓损伤的实验研究实验一急性脊髓损伤动物模型的建立与评价目的:建立大鼠急性脊髓损伤模型,研究SCI后脊髓中NF200变化情况,以及大鼠行为学的变化规律。方法:应用改良Allen’s打击法建立急性脊髓损伤模型,于损伤后2周,分别进行NF200染色及轴突计数,同时进行斜板试验,观察其变化。结果:与对照组相比,NF200染色中形态学差别明显,在轴突计数与斜板试验中比较,差异均有显著性意义(P<0.05)。结论:此脊髓损伤动物模型制作方便,制作模型过程中的操作对大鼠的创伤小,形成的损伤稳定、重复性好,能够反映人脊髓损伤的病理生理过程,该模型可用于脊髓损伤的实验研究。实验二VEGF修饰神经干细胞移植对急性脊髓损伤的作用目的:探讨VEGF转染神经干细胞移植对大鼠急性脊髓损伤的康复治疗作用。方法:将64只大鼠,应用改良Allen’s打击法建立急性脊髓损伤模型,随机分为4组:对照组、NSCs移植组、EGFP-NSCs移植组和VEGF-EGFP-NSCs移植组,在损伤后3天分别进行移植治疗。在移植后2周,用NSE免疫荧光染色观察移植后神经干细胞情况,Western blot法检测VEGF表达,TUNEL染色法检测细胞凋亡情况,行为学评分观察对神经功能恢复的影响。结果:移植后2周,可见EGFP和NSE双标的细胞,Western blot示VEGF-EGFP-NSCs组中VEGF表达明显高于其余组;TUNEL染色示凋亡细胞明显低于其余组;运动功能评分明显高于其余组。差异均有显著性意义(P<0.05)。结论:植入的NSCs能在脊髓内存活并分化,且VEGF对急性脊髓损伤有减轻凋亡、促进运动神经功能恢复的作用。