清开灵注射液是北京中医药大学研制,由板蓝根、栀子、金银花、水牛角、珍珠母、黄芩苷、胆酸和猪去氧胆酸8味主要药物组成,治疗中风、肝炎、病毒性脑炎疗效确切的中药复方注射剂,近年来,其临床应用也拓展至急性中毒、肿瘤、慢性肾功能不全等疾病的救治。但因用药同时产生较多不良反应,限制了其在临床的广泛应用。对其所导致的不良反应分析发现,大部分患者为首次用药30min内即产生过敏反应症状。根据其首发性与速发型,推测与类过敏反应有关。研究发现,清开灵注射液的致敏机制可能主要为非IgE介导,直接刺激肥大细胞、嗜碱性粒细胞脱颗粒,通过释放大量过敏性介质,诱发一系列类过敏反应。目前我国尚无中药注射剂类过敏反应检测的指导原则和检测模型,建立敏感可靠的类过敏反应研究模型是解决中药注射剂临床不良反应问题的当务之急。根据类过敏反应发生的机制,体外细胞模型需模拟肥大细胞(mast cell, MC)释放过敏介质。大鼠嗜碱性白血病细胞栋(Rat basophilic leukemia cell line, RBL-2H3)是MC的理想替代模型,能模拟有关MC的生理、病理反应,是研究介质释放和鉴定抗过敏药物的重要模型。药代动力学研究技术在代谢组学研究中,相比其他传统研究手段,对中国医药现代化具有更大的优势。到目前为止,尚没有使用icELISA方法考察在细胞内药代动力学的研究。作为一种集准确性和简洁性于一身的药代动力学检测的有效方法,icELISA是的药代动力学研究一个新的发展,已经引起了广泛关注。近年来,人们普遍研究血液、尿液和唾液中的药代动力学,然而,一些研究发现,不同于畅通的药代动力学研究,很多药物如抗生素、抗癌药、抗疟药等均以细胞为作用靶点。因此,本研究采用体外的细胞模型,从微观层次上更准确、更直观的反应药物的药代动力学。现将研究结果总结如下：1清开灵注射液及其中间品对RBL-2H3细胞增殖的影响的实验研究目的：研究不同浓度的清开灵注射液及其生产过程中的中间品对RBL-2H3细胞增殖的影响,为建立相应类过敏细胞模型及利用该模型评价清开灵注射液及其中间品的不良反应,进而全流程监控药品质量奠定基础。方法：将清开灵注射液及其中间品分别以体积比1/4为初始浓度,两倍稀释至1/4096,共11个浓度作用于RBL-2H3细胞,于倒置显微镜下观察细胞形态,用四甲基偶氮唑盐法测定不同浓度清开灵注射液及其中间品对RBL-2H3细胞生长的抑制作用,并计算IC50。结果：不同浓度的清开灵注射液及其中间品对RBL-2H3细胞生长具有明显促进和抑制作用(P<0.05)。结论：MTT实验可用于评价细胞增殖活性；测定并计算各IC50,可用于进一步建立相应类过敏细胞模型,探讨细胞增殖活性与类过敏反应的关系,评价清开灵注射液及其中间品的不良反应及全流程的监控药品质量。2清开灵注射液及其中间品类过敏反应的实验研究目的：研究清开灵注射液及其生产过程中的中间品对RBL-2H3细胞脱颗粒的影响,评价清开灵注射液及其中间品的类过敏反应。方法：四甲基偶氮唑盐法测定不同浓度清开灵注射液及其中间品对RBL-2H3细胞生长的抑制作用,并计算IC50。将清开灵注射液以五个不同浓度稀释,其中间品以IC50浓度稀释,分别作用于RBL-2H3细胞,45min后,底物显色法测定β-氨基己糖苷酶释放度；ELISA法测定组胺释放量。结果：不同浓度的清开灵注射液对RBL-2H3细胞脱颗粒程度并无浓度依赖性,但最高浓度下脱颗粒程度相对较高。同时,在其不同中间品中,金银花促进RBL-2H3细胞脱颗粒作用最明显。结论：在体外,不同浓度的清开灵注射液均可不同程度的引起肥大细胞脱颗粒,释放活性物质,引起类过敏反应,而金银花可能是致敏的主要成分。本研究为进一步研究清开灵注射液不良反应的作用机制提供实验依据。3免疫亲和层析敲除法对中药注射液中的绿原酸的敲除及其类过敏反应变化的研究目的：利用免疫亲和层析柱敲除清开灵注射液和热毒宁注射液中的绿原酸,运用对比研究方法进行绿原酸敲除前后细胞脱颗粒程度的评价。方法：利用绿原酸单克隆抗体,经琼脂糖凝胶活化、抗体偶联、封闭、洗杂、平衡后,装柱并制备绿原酸免疫亲和层析柱。建立敲除样品的指纹图谱,并进行β-氨基己糖苷酶释放度的测定。结果：制备了绿原酸免疫亲和层析柱,并对清开灵注射液和热毒宁注射液中的绿原酸进行了敲除,测得两种注射液在敲除CA后,β-氨基己糖苷酶释放度均不同程度上明显降低(p<0.05),结论：说明CA是中药注射液致敏的可怀疑因素。4基于ELISA方法的清开灵注射液中的黄芩苷在RBL-2H3细胞内的药代动力学研究目的：建立清开灵注射液(QKLI)中黄芩苷(BAL)在RBL-2H3细胞中的ELISA定量分析方法,并用于研究其在体外体外药代动力学过程,检测相关实验参数。方法：将高浓度和低浓度稀释的清开灵注射液分别作用于RBL-2H3细胞,设定不同时间点取细胞上清,ELISA法测定各个时间点细胞上清中BAL含量,从总给药量中剔除,所得结果则为细胞内BAL含量。并且测定QKLI中BAL在RBL-2H3细胞中药代动力学的各基本参数。结果：用RBL-2H3细胞空白上清建立标准曲线,测得其有效线性范围为5ng/mL-320ng/mL,回归方程为Y=-0.14871n(C)+1.2203, R2=0.994, IC50值为126.97ng?mL-1,变异系数<10%。经药代动力学软件Kinetica5.0计算,得到基本药代动力学参数：高浓度组Tmax=90min, Cmax=426.59ng?mL-1, AUClast=36.21ug?mL-1, AUCextra=12.25ug?mL-1, AUCtot=48.46ug?mL-1, MRT=91.07min;低浓度组Tmax=90min, Cmax=82.43ng? mL-1, AUClast=5.11ug? mL-1, AUCextra=0.71ug? mL-1, AUCtot=5.82ug? mL-1, MRT=74.64min。结论：本研究建立的微量细胞内QKLI中BAL的ELISA分析方法简便、灵敏、可靠,可用于细胞内QKLI中BAL浓度的分析及药代动力学的研究。