青蒿（Artemisia annua L.）是菊科蒿属一年生草本植物,作为传统中草药有着悠久的入药历史,具有清热、解暑、凉血之效;现代医学研究表明,其含有的倍半萜内酯青蒿素,具有显著的抗疟原虫活性。除青蒿素外,青蒿中还含有丰富的其它萜类化合物;现有研究表明,萜类化合物不仅能够参与植物的形态建成及逆境胁迫响应进程,同时作为原材料被人类广泛应用于食品、化工及制药等行业。萜类物质的生物合成及调控研究一直是相关领域研究的热点。前人研究显示,萜类合成酶基因在青蒿基因组中发生了大规模的扩张从而导致青蒿中萜类物质较为丰富。在青蒿中,倍半萜是其萜类化合物的主要成分之一,如青蒿素（artemisinin）、β-法尼烯（β-farnesene）、雪松醇（epi-cedrol）和β-石竹烯（β-caryophyllene）等,上述化合物均起源于法尼基焦磷酸FPP,而后分别由不同类型的倍半萜合成酶如AaADS、AaBFS、AaECS和AaCPS等催化生成。合成途径基因的鉴定为开展倍半萜转录调控研究奠定了重要的基础,但是截至到目前,前人更多关注于青蒿素的生物合成及代谢调控研究,而关于非青蒿素倍半萜代谢调控研究鲜有报道。因此,以青蒿为研究材料,开展倍半萜类生物合成调控研究具有重要的研究价值和理论意义。本团队前期在青蒿中鉴定获得了一个bHLH类型转录因子（AabHLH106）,研究发现其对青蒿素倍半萜生物合成过程中的关键酶基因AaADS的表达具有调控作用;由于AaADS与其它倍半萜合成酶基因如AaBFS、AaCPS和AaECS等具有共同的起源,且催化底物均为FPP,据此推测AabHLH106可能参与了其它非青蒿素倍半萜化合物的生物合成调控。基于此,本研究采用分子生物学、生物化学和植物基因工程等多学科技术手段,对AabHLH106在青蒿非青蒿素倍半萜生物合成中的代谢功能及其调控的分子机制进行了深入研究。相关研究结果如下:1.AabHLH106在倍半萜生物合成部位-腺毛体中高水平表达基因的表达定位与其生物学功能密切相关。本研究基于青蒿基因组数据库,获得了AabHLH106基因组的电子序列,并使用PCR技术克隆获得了AabHLH106启动子的物理序列（2097bp）。基于启动子分析网站（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plant care/html/）,对AabHLH106启动子上的顺式作用元件进行了分析,分析结果显示,AabHLH106启动子存在有与生长、代谢及防御反应相关的多种类型顺式作用元件。为了考察AabHLH106的表达定位情况,本研究构建了AabHLH106启动子功能验证载体pAabHLH106::GUS,并基于农杆菌EHA105介导获得了pAabHLH106::GUS转基因青蒿植株;进一步对转基因植株进了GUS染色,结果显示AabHLH106在青蒿叶片腺毛体中高水平表达,这与前人报道的青蒿素等倍半萜生物合成的部位相符。2.AabHLH106能够激活AaBFS、AaCPS和AaECS启动子对下游基因的转录生物合成途径基因和转录因子的发掘鉴定是开展转录调控的重要前提。前人对青蒿倍半萜生物合成途径部分基因进行了功能鉴定,如AaBFS、AaCPS、AaECS和AaGAS等基因,研究表明上述基因是β-法尼烯、β-石竹烯、雪松醇和吉玛烯A等倍半萜生物合成途径中的关键酶,前人对上述途径基因的克隆鉴定为本研究提供了重要的靶标基因。本研究基于Dual-luc技术研究了AabHLH106对倍半萜生物合成途径部分基因的转录激活作用,研究结果表明AabHLH106能够激活AaBFS、AaCPS和AaECS启动子对下游基因转录;进一步的Y1H实验结果表明AabHLH106能够与AaCPS和AaECS的启动子直接结合,但是不能够与AaBFS的启动子直接结合。上述研究初步表明AabHLH106能够正调控青蒿倍半萜合成酶基因AaBFS、AaCPS和AaECS的转录表达。3.AabHLH106在青蒿倍半萜β-法尼烯、β-石竹烯和雪松醇生物合成中发挥着重要的调控作用（1）AabHLH106过表达/RNAi转基因植株的获得为进一步研究AabHLH106的代谢调控功能,本研究分别构建AabHLH106的过表达/RNAi植物表达载体p HB-AabHLH106和p Bin19-AabHLH106;并基于青蒿遗传转化再生体系创建了上述植物表达载体的转基因青蒿植株。基因组PCR检测结果显示上述携带有目标序列的T-DNA被成功的整合到了青蒿的基因组上;q PCR检测结果表明,在过表达AabHLH106青蒿株系中,AabHLH106及倍半萜合成酶基因AaBFS、AaCPS和AaECS的表达量得到了显著上调,而在RNAi-AabHLH106青蒿株系中,AabHLH106及倍半萜合成酶基因AaBFS、AaCPS和AaECS的表达均被显著抑制。上述结果表明,本研究成功获得了理想的AabHLH106过表达/RNAi转基因青蒿,可用于后续的研究分析。（2）过表达AabHLH106促进了青蒿倍半萜β-法尼烯、β-石竹烯和雪松醇的合成在成功获得过表达AabHLH106转基因青蒿后,本研究基于GC-MS检测系统,对转基因植株中非青蒿素倍半萜的含量进行了相关检测。代谢物检测结果显示,在过表达AabHLH106株系中,β-法尼烯、β-石竹烯和雪松醇的含量较野生型株系相比均显著提高,其中β-法尼烯的含量增加了176.9%～401.9%,β-石竹烯的含量增加了65.8%～470.7%,雪松醇的含量增加了30.6%～84.7%。该部分研究结果表明,过表达AabHLH106能够显著促进β-法尼烯、β-石竹烯和雪松醇的生物合成。（3）沉默AabHLH106表达抑制了青蒿倍半萜β-法尼烯、β-石竹烯和雪松醇合成在成功获得RNAi-AabHLH106转基因青蒿后,本研究对RNAi-AabHLH106转基因植株中非青蒿素倍半萜的含量也进行了检测分析,结果显示,在RNAi-AabHLH106株系中,β-法尼烯、β-石竹烯和雪松醇的含量较野生型株系相比均显著下降,其中β-法尼烯的含量降低了35.6%～57.6%,β-石竹烯的含量降低了60.0%～74.5%,雪松醇的含量降低了40.8%～52.1%。上述结果表明,AabHLH106的基因沉默对青蒿中β-法尼烯、β-石竹烯和雪松醇的生物合成具有显著的抑制作用。综上所述,本研究采用分子生物学和生物化学等多学科手段对在青蒿腺毛体中高水平表达的AabHLH106在非青蒿素倍半萜生物合成中的调控功能进行了深入研究。综合Dual-luc和Y1H研究结果以及对转基因植株材料的分子检测和代谢物检测结果分析,可以得出如下结论:AabHLH106通过直接调控AaCPS和AaECS基因的表达,进而促进β-石竹烯和雪松醇的生物合成,同时通过间接调控AaBFS基因的表达来调控β-法尼烯的生物合成。本研究有利于揭示AabHLH106调控青蒿倍半萜生物合成的分子机制,完善青蒿萜类物质代谢调控网络,具有重要的科学意义;AabHLH106的功能鉴定也为后期开展萜类化合物代谢工程研究提供了重要的技术支撑。