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背景和目的骨关节炎（Osteoarthritis,OA）是一种关节退行性疾病,软骨病变是OA病变的核心。软骨细胞自噬缺失在OA发病机制中起关键作用。维生素D是一种脂溶性激素,对人体骨骼健康至关重要。OA患者常伴随维生素D缺乏,补充维生素D有助于患者疼痛改善,缓解关节结构进展,然而维生素D在OA中的作用机制尚不清楚。本研究在于探索维生素D对骨关节炎患者软骨细胞自噬通路的影响,在此基础上进一步阐明维生素D对OA的保护作用机制。方法我们从行膝关节置换术OA患者的胫骨表面软骨中分离软骨细胞,并使用甲苯胺蓝染色和免疫组化对细胞进行鉴定。采用内侧半月板切除术构建OA大鼠模型（即内侧半月板不稳定模型）。通过CCK8和HE染色分别检测维生素D作用下体内外软骨细胞增殖情况,采用TUNEL染色检测软骨细胞凋亡情况,运用WB检测了相关凋亡蛋白（Caspase3,Bcl-2,Bax）表达。运用番红-固绿染色检测了维生素D作用下软骨蛋白多糖表达,通过WB和qRT-PCR检测OA相关蛋白和mRNA表达（包括COL2A1,MMP13和VEGF）。确定维生素D对OA的作用后,我们通过WB检测了自噬相关蛋白（包括p62,Beclin-1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值）表达,为进一步探索维生素D对自噬过程的影响,我们采用mRFP-GFP-LC3腺病毒转染检测LC3在软骨细胞表达,通过Lyso-Tracker Red染色检测溶酶体活性,采用透射电镜观察自噬溶酶体超微结构;并且通过免疫组化观察LC3在大鼠关节软骨表达。通过WB确定自噬通过AMPK/mTOR信号通路后,我们运用siRNA在体内外进行转染,分别敲低AMPK和mTOR,通过WB,qRT-PCR,HE和番红O-固绿染色分别检测自噬和OA相关蛋白和mRNA表达以及细胞凋亡、蛋白多糖表达。为验证NF-κB在软骨细胞中对自噬活性的影响,我们通过大鼠关节腔注射siRNA对软骨细胞的NF-κB进行敲低,通过WB,qRT-PCR,HE和番红O-固绿染色分别检测自噬和OA相关蛋白和mRNA表达以及细胞凋亡、蛋白多糖表达。为确定NF-κB发挥作用的具体机制,通过WB,qRT-PCR检测细胞中总的和胞核中的p65,p-p65,维生素D受体（Vitamin D receptor,VDR）表达,运用NF-κB入核实验和免疫组化检测p-p65的核内表达情况,通过免疫共沉淀检测NF-κB和VDR蛋白质之间的相互作用。并运用WB,qRT-PCR检测维生素D作用下IκBα,p-IκBα的表达,通过转染siRNA对软骨细胞的VDR和IκBα进行敲低,通过WB,qRT-PCR,HE和番红O-固绿染色分别检测自噬和OA相关蛋白和mRNA表达以及细胞凋亡、蛋白多糖表达。结果1.甲苯胺蓝染色可见软骨细胞外周由少量蓝紫色异染颗粒出现,细胞胞质呈蓝紫色,胞核呈深蓝色,核仁明显。Ⅱ型胶原免疫组化染色显示软骨细胞形态规则,可见棕黄色异染颗粒,细胞核呈深褐色,胞质呈浅棕黄色。2.在体内外,维生素D促进OA软骨细胞增殖,减少软骨细胞凋亡。3.维生素D减轻了IL-1β和DMM诱导的软骨基质中分解代谢,包括促进COL2A1和蛋白多糖表达,抑制VEGF和MMP-13表达。4.维生素D促使软骨细胞自噬相关蛋白LC3Ⅱ表达增加,溶酶体活性增强,并诱导自噬溶酶体形成,从而发挥胞内细胞器和非必要物质的降解,维持内稳态平衡。5.维生素D通过AMPK/mTOR信号通路参与软骨细胞自噬激活,通过敲低mTOR激活自噬,可以减少大鼠关节软骨细胞和蛋白多糖的丢失,延缓OA进程;敲低AMPK,激活mTOR磷酸化,或直接抑制自噬,诱导软骨细胞减少和蛋白多糖丢失增加。6.在软骨细胞中,敲低NF-κB能够通过调节AMPK/mTOR相关信号通路激活自噬,减少软骨细胞凋亡和ECM降解,延缓OA进程。7.维生素D通过VDR与NF-κB相互作用抑制NF-κB磷酸化,减少磷酸化NF-κB入核。8.维生素D可能直接抑制IκBα磷酸化或通过VDR转录因子调控IκBαmRNA表达,促进IκBα与NF-κB相互作用,减少NF-κB磷酸化入核。9.敲低VDR和IκBα可以抑制软骨细胞自噬,诱导软骨细胞凋亡和ECM降解。结论1.维生素D通过抑制NF-κB诱导自噬通路增加是OA病情缓解的关键。2.维生素D主要以两种方式抑制NF-κB的活性:一方面通过VDR与NF-κB相互作用稳定NF-κB;另一方面通过VDR调控IκBα表达,增加IκBα与NF-κB结合,抑制NF-κB激活。维生素D通过抑制NF-κB调节AMPK/mTOR信号通路从而促进自噬,对OA具有保护作用。3.维生素D通过抑制NF-κB调节AMPK/mTOR信号通路从而促进自噬,对OA具有保护作用。维生素D可作为治疗OA的有效制剂,并且具有研究和应用潜能。