传统的神经干细胞培养模式分为“悬浮培养”和“单层贴壁培养”。但这两种方式都存在不可回避的缺点。近年来,三维培养技术逐渐成为细胞培养领域研究的热点,这种培养方式可以使细胞呈空间立体方式生长,使其更接近于体内生长模式,形成类似体内组织的结构,发挥其功能。由于三维培养模式既有利于诱导细胞的定向分化及分化后表型的维持,又有望在体外构建与各类组织、器官相应的细胞三维生长类似物或等同物,因此,这项培养技术对组织工程学和临床应用都有重要意义。本论文采用三维培养模式培养神经干细胞。实验选择使用天然的生物材料鼠尾Ⅰ型胶原蛋白与壳聚糖复合作为细胞的支架材料。首先考察了胶原蛋白与神经干细胞的生物相容性,包括生物安全性和生物功能性。然后将鼠尾Ⅰ型胶原蛋白与壳聚糖通过低温冻干并交联,再进行2次冻干制备胶原-壳聚糖复合支架,应用扫描电镜观察其表面的微观结构,并通过细胞实验,说明神经干细胞与复合支架的相容性,最后采用激光扫描共聚焦显微镜观察支架上经免疫荧光染色后的神经干细胞,获得以下结果:(1)胶原与神经干细胞的生物相容性:单个神经干细胞均匀分散在胶原凝胶内,培养3天后,细胞间界限不很清楚,出现神经细胞团簇;胶原凝胶中的神经干细胞生长活力良好,大部分呈Nestin、BrdU阳性;细胞培养的最优胶原浓度为0.5mg/ml,细胞的最适接种密度是1×10~6cells/ml。(2)胶原-壳聚糖复合支架的制备及性能:采用低温冻干法,5mg/ml的鼠尾Ⅰ型胶原和2%壳聚糖分别以体积比9:1、7:3、5:5制备复合支架,支架的孔径、吸水率、降解率等结果显示,体积比为7:3的复合支架更适合于细胞的生长和粘附。(3)统计分析数据表明,胶原-壳聚糖复合支架具有较好的细胞亲和性,神经干细胞能够沿着不规则的孔道壁粘附、伸展、延伸,细胞的活力检测结果显示:培养至第6天的神经干细胞具有73±2.8%的高活率,荧光染色结果表明:复合支架内的神经干细胞能够分化为神经元和胶质细胞,维持了干细胞的特性。由以上实验结果我们推断:胶原-壳聚糖复合支架适用于神经干细胞的三维培养,有望成为神经组织临床移植的应用材料。