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马铃薯Y病毒(Potato virus Y, PVY)是我国烟草种植区域流行的优势病毒,对烟草生产造成了严重经济损失。本文在辽宁烟区采集、纯化了引起烟草叶脉坏死症状的代表性毒株(PVY辽宁分离物,PVY-LN),获得了PVY-LN基因组全序列并确定了其株系,构建了PVY-LN侵染性克隆,明确了PVY-LN致烟草叶脉坏死症状的致病因子,结果报告如下：1.以GenBank中已有的PVY全序列为基础设计特异引物,利用RT-PCR和RACE (rapid-amplification of cDNA ends)技术,成功获得了PVY-LN基因组全序列(NCBI登录号为JQ971975)。PVY-LN全长基因组序列包括9714个碱基(含PolyA尾),整条序列仅包含一个由9186个碱基组成的开放读码框(ORF),编码一条包含3061个氨基酸的多聚蛋白。对所得序列进行BLAST分析,利用MEGA软件对所测得的PVY-LN全序列与GenBank中已有的PVY全序列及氨基酸进行系统进化分析,发现PVY-LN与已报道的PVY坏死株系(PVYN)具有较高的进化亲缘关系,该分离物属于PVYN。序列重组分析软件RDP4分析,PVY-LN序列无重组。2.将PVY-LN全长序列(含PolyA尾)构建到pBlueScript SK(+)载体上,获得了由T7启动子控制的侵染性克隆pBlPVY-LN,经体外转录接种云烟87、血清学及RT-PCR检测,该侵染性克隆具有侵染性,侵染率达13.3%。本文另外还构建了35S启动子控制下的侵染性克隆,但未挑选到阳性克隆,未获得具有侵染性的35S启动子控制下的侵染性克隆。3.明确了PVY-LN致烟草叶脉坏死症状的相关核苷酸序列,即5540nt-6491nt；经BLAST分析,该段序列含有两个蛋白保守结构域,进一步研究证实,只要其中一个蛋白结构域存在就能引起烟草叶脉坏死症状。首先,在全长侵染性克隆构建的基础上,构建替换突变体pB1P VY-LN-DrSw、pB1P VY-LN-S wNc和pBlPVY-LN-NcBg,突变体侵染烟草后观察症状及RT-PCR检测突变体侵染性克隆具有侵染性,其中pB1PVY-LN-SwNc表现花叶症状,其他两个突变体表现烟草叶脉坏死症状,说明PVY-LN的Swa I和Nco I两个酶切位点间的序列(核苷酸5540nt-6491nt)对烟草表现叶脉坏死症状起关键作用；经Protein Blast分析,该段序列含有两个蛋白质保守结构域,为了研究这两个蛋白保守结构域与烟草表现叶脉坏死症状是否相关,进一步构建了替换突变体侵染性克隆pB1PVY-LN-R1、pB1PVY-LN-R2和pB1PVY-LN-R3,以期将这两个结构域分开,突变体侵染性克隆接种烟草,症状观察及RT-PCR检测结果表明,突变体侵染性克隆pB1PVY-LN-R1、pB1PVY-LN-R2和pB1PVY-LN-R3侵染烟草烟草均表现叶脉坏死症状,说明上述两个蛋白结构域只要其中一种蛋白结构域存在便能引起烟草表现叶脉坏死症状。明确PVY辽宁分离物PVY-LN致烟草叶脉坏死症状的致病因子。