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目的:1、探究炎性环境及铁过载能否诱导软骨细胞发生铁死亡。2、探究铁死亡对软骨细胞及关节软骨表型产生的影响。3、探究炎性环境及铁过载环境下Nrf-2抗氧化系统的激活水平及其与软骨细胞铁死亡的关系。4、探究铁死亡抑制剂Ferrostatin-1对OA病理进展的影响。方法:1、我们用白细胞介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）处理小鼠软骨细胞以在体外条件下模拟炎性环境,用枸橼酸铁铵（Ferric ammonium citrate,FAC）处理小鼠软骨细胞以在体外条件下模拟铁过载环境。用透射电镜观察线粒体是否发生铁死亡特征性的形态学改变;检测铁死亡关键蛋白GPX4的表达水平及其细胞内分布,并检测ACSL4、P53和SLC7A11三个细胞铁死亡常见蛋白标志物的表达水平;检测细胞内活性氧（Reactive oxygen species,ROS）、脂质ROS（Lipid ROS）及脂质过氧化代谢产物丙二醛（Malondialdehyde,MDA）的水平。2、我们通过铁死亡抑制剂Ferrostatin-1处理炎性环境（IL-1β处理）或铁过载（FAC处理）的小鼠软骨细胞,检测其对细胞内ROS、Lipid ROS及MDA水平的影响;用CCK-8法检测铁死亡抑制剂Ferrostatin-1对IL-1β和FAC细胞毒性的抑制作用;检测Ferrostatin-1对GPX4、ACSL4、P53和SCL7A11四个铁死亡蛋白标志物的表达水平及GPX4蛋白胞内分布的影响。3、我们用经典的铁死亡诱导剂Erastin处理小鼠软骨细胞,并通过蛋白免疫印迹实验检测软骨细胞GPX4表达水平的改变以验证Erastin的诱导效果,并进一步检测其对MMP13和CollagenⅡ表达水平的影响。同时,我们给予小鼠关节腔注射Erastin,并通过免疫组化染色检测关节软骨中MMP13和CollagenⅡ表达水平的改变,进一步验证体外实验的结果。4、我们用铁死亡经典的抑制剂Ferrostatin-1处理炎性环境（IL-1β处理）或铁过载（FAC处理）的小鼠软骨细胞,并检测Ferrostatin-1对MMP13和CollagenⅡ的表达水平的影响。5、我们用siRNA沉默炎性环境（IL-1β处理）及铁过载（FAC处理）小鼠软骨细胞Nrf-2的表达,并检测GPX4的表达水平,以验证Nrf-2对细胞铁死亡的调控作用。我们用Ferrostatin-1处理炎性环境（IL-1β处理）或铁过载（FAC处理）的小鼠软骨细胞,并检测Nrf-2及其下游抗氧化效应分子HO-1、NQO-1和Trx蛋白的表达水平,以检测炎性环境或铁过载环境下软骨细胞Nrf-2抗氧化系统的激活水平及Ferrostatin-1对Nrf-2抗氧化系统激活水平的影响。6、我们通过手术构建小鼠膝关节内侧半月板不稳定（Destabilization of medial meniscus,DMM）,建立小鼠OA模型。治疗组给予关节腔注射Ferrostatin-1（低浓度组为0.1mg/kg体重;高浓度组为1mg/kg体重;一周2次,连续8周）,假手术组及OA模型组给予注射等量的溶剂。通过番红固绿染色观察关节软骨的退变程度,并根据OARSI（Osteoarthritis Research Society International）评分评估OA的病理进展程度,通过免疫组化染色检测关节软骨中GPX4蛋白及CollagenⅡ的表达水平。结果:1、在IL-1β和FAC处理的软骨细胞均出现了具有铁死亡特征性形态改变的线粒体;同时IL-1β和FAC均能抑制小鼠软骨细胞GPX4和SCL7A11蛋白的表达、同时促进ACSL4和P53蛋白的表达。免疫荧光染色也显示GPX4蛋白的荧光强度显著降低,正常于胞浆内呈均匀而弥散分布的颗粒状荧光也明显减少或消失;IL-1β和FAC均会导致小鼠软骨细胞内的ROS、Lipid ROS和MDA过度累积。2、铁死亡抑制剂Ferrostatin-1能抑制IL-1β和FAC的细胞毒性,明显减少炎性环境（IL-1β处理）及铁过载条件下（FAC处理）细胞内ROS、Lipid ROS和MDA的产生,上调GPX4和SCL7A11蛋白的表达,并下调ACSL4和P53蛋白的表达。3、经典的铁死亡诱导剂Erastin在体内体外均能抑制CollagenⅡ的表达水平,刺激软骨细胞高表达MMP13。4、Ferrostatin-1能逆转IL-1β和FAC所致的CollagenⅡ表达抑制,而Ferrostatin-1对IL-1β和FAC诱导的MMP13高表达没有明显的抑制作用。5、用siRNA沉默炎性环境（IL-1β处理）及铁过载环境（FAC处理）下软骨细胞Nrf-2的表达会使GPX4蛋白的表达水平降低。IL-1β处理软骨细胞能提高Nrf-2及其下游抗氧化效应分子HO-1、NQO-1和Trx蛋白的表达水平,而用铁死亡抑制剂Ferrostatin-1和IL-1β同时处理能使这些蛋白的表达水平进一步升高;FAC对Nrf-2、HO-1、NQO-1和Trx蛋白的表达水平无明显影响,而用铁死亡抑制剂Ferrostatin-1和FAC同时处理能使这些蛋白的表达水平明显升高。6、免疫组化染色显示OA组的GPX4蛋白表达水平明显降低。关节腔注射1mg/kg体重的Ferrostatin-1能减轻关节软骨的退变、降低OARSI评分。同时我们发现关节腔注射1mg/kg体重的Ferrostatin-1能提高关节软骨CollagenⅡ和GPX4蛋白的表达水平。结论:1、炎性环境（IL-1β处理）及铁过载（FAC处理）均能诱导软骨细胞发生铁死亡。2、经典的铁死亡诱导剂Erastin在体内体外均能抑制软骨细胞CollagenⅡ的表达并促进软骨细胞合成MMP13,而铁死亡抑制剂Ferrostatin-1能逆转IL-1β和FAC所致的CollagenⅡ表达抑制。说明铁死亡会导致软骨细胞发生与OA软骨细胞相似的表型改变。3、Nrf-2抗氧化系统的失活会提高炎性环境和铁过载环境下软骨细胞铁死亡的水平。Nrf-2抗氧化系统在炎性环境下虽然被激活,但其激活水平较低,铁死亡抑制剂Ferrostatin-1能显著提高炎性环境下Nrf-2抗氧化系统的激活水平。虽然铁过载会导致明显的氧化应激,但Nrf-2抗氧化系统在铁过载环境下却未被激活,而Ferrostatin-1能使铁过载环境下Nrf-2抗氧化系统激活。因此Nrf-2抗氧化系统在炎性环境下激活水平较低、尤其是在铁过载条件下不激活可能是铁死亡发生的一个重要因素。4、OA小鼠关节软骨中的GPX4蛋白水平明显降低,关节腔注射1mg/kg体重的Ferrostatin-1能减轻关节软骨的退变、促进CollagenⅡ和GPX4蛋白的合成、延缓OA的病理进展。5、我们的研究说明软骨细胞的铁死亡参与了OA的病理进展,而抑制软骨细胞铁死亡可能成为OA新疗法潜在的理想靶点。