研究目的全球每年约有一千五百万早产儿诞生,早产儿是新生儿死亡的主要原因,并且存活下来的早产儿也面临脑组织损伤等远期问题。因此,如何预防早产及保护围生儿脑组织免于损伤成为现代围产医学一个非常重要的研究课题。越来越多的临床证据表明宫内感染所致绒毛膜羊膜炎(chorioamnionitis, CAM)是导致早产的高危因素,是子代脑组织损伤及远期不良神经系统预后的重要原因。然而,绒毛膜羊膜炎发病隐匿,多数无明显临床症状,主要依赖产后胎盘的组织学诊断,往往诊断和治疗滞后,难以研究其致病机制及给予早期干预和治疗。因此,我们前期采用了国际上最常使用的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导法建立宫内感染孕鼠模型,拟在此基础之上研究宫内感染与早产和子代脑组织损伤的关系,目的是为了寻找及优化一种早期干预和治疗措施,来改善宫内感染孕鼠早产结局和预防其子代脑组织损伤。N-乙酰L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine, NAC)具有抗炎、抗氧化作用及调节细胞凋亡等功能。激活的小胶质细胞可产生多种炎症因子,在新生儿脑损伤中起着重要的作用。它在激活后具有吞噬特性,能够摄取纳米颗粒。因此,人们设计了N-乙酰-L-半胱氨酸树状大分子(dendrimer-based N-acetyl-L-cysteine, DNAC)纳米材料,并证实其能选择性地被激活的小胶质细胞摄取,具有靶向控制炎症、保护脑组织免于损伤的作用。因此,我们设想在前期已建立宫内感染孕鼠模型的基础上,应用DNAC对宫内感染孕鼠进行干预,目的是系统研究：1)宫内感染对早产及子代神经系统损伤的影响；2)DNAC纳米材料对宫内感染孕鼠模型早产结局的预防作用；3)DNAC纳米材料对宫内感染孕鼠模型子代脑组织损伤的保护作用；4)DNAC纳米材料预防早产及改善子代脑组织损伤的相关机制。研究方法将购自Charles River实验室的孕17天CD-1小鼠,分为非手术组及手术组,手术组分为生理盐水组(normal saline, NS)和LPS组,行剖腹手术并于右侧子宫角第一、二胚胎之间注射NS100ul或者25ugLPS(溶于100ulNS中)。术后1小时NS组和LPS组分别接受腹腔注射DNAC 150ul (10mg/kg)。1.术后24小时观察早产情况并计算早产率；2.出生后5、9、13天小鼠进行神经行为学评估；3.术后6小时,剖宫留取胎盘和胎鼠脑组织,观察：(1)胎盘和胎鼠脑组织的凋亡基因caspase3的表达；(3)胎盘内急性炎症期STAT3和NFκB p65基因的表达、促炎因子的变化和免疫细胞CD3+T细胞的浸润情况；(4)胎鼠脑皮质和脑室区小胶质细胞的激活状况；4.出生17天的小鼠脑皮质和海马区小胶质细胞的激活状况。结果1. DNAC可降低宫内感染孕鼠模型的早产率。在同胎产仔数无明显差异的情况下,LPS组(n=12)早产率最高,为83%。LPS+DNAC组(n=13)早产率为31%。LPS组与对照组相比,早产率明显升高；应用DNAC后,早产率明显下降。(p值<0.05)。表明：LPS所致宫内感染可引起早产发生,DNAC治疗可明显降低宫内感染所诱发的早产。2. DNAC可改善宫内感染孕鼠子代神经行为学的异常表现在出生后5、9、13天进行平面翻正、悬崖回避、负趋反射和小鼠移动实验来评估其神经行为学状况。运动能力的评估通过平面运动、负趋实验完成,认知能力的评估通过悬崖回避和小鼠移动实验完成。结果显示：出生后5天,没有幼鼠能够完成小鼠移动实验,其它二组实验中,LPS组幼鼠运动和认知行为明显受损,LPS+DNAC组明显改善。生后9天及第13天,所有实验均显示,LPS组受损,LPS+DNAC组明显改善。(p值具有统计学意义)。表明：LPS所致的宫内感染可影响子代脑神经系统的发育,DNAC治疗可以减轻宫内感染所致的子代脑神经系统的损害。3. DNAC降低了胎鼠脑组织中活性Caspase3的表达。采用western blot检测胎盘组织和胎鼠脑组织中caspase 3的表达。Image J分析蛋白印迹密度,计算cleaved caspase 3 (caspase 3的活性形式)和pro-caspase3的比值。结果显示：胎盘组织中各组间caspase 3的活性没有明显改变；胎鼠脑组织中LPS组和NS组比较,caspase 3的活性明显升高,LPS+DNAC组和LPS组比较,caspase 3的活性明显降低(p值具有统计学意义)。表明：宫内感染对于胎盘组织的凋亡无明显影响,但是可促进子代脑组织细胞的凋亡；DNAC治疗后,可显著抑制子代脑细胞的凋亡,起到保护脑组织及功能的作用。4. DNAC抑制了胎盘急性炎症期STST3活性状态的表达和炎症因子的分泌4.1 NFκB p65和STAT3在细胞急性炎症反应中具有重要作用,p65和STAT3都需要磷酸化后才能被激活。为了评估免疫活性功能,我们采用western blot检测了胎盘组织中磷酸化STAT3(pSTAT3)及总STAT3,磷酸化p65(p-p65)和总p65。计算pSTAT3/STAT3和P-p65/p65的比值。结果显示：P-p65/p65的比值在各组之间无明显变化；pSTAT3/STAT3的比值,LPS组较NS组明显升高,LPS+DNAC组较LPS组明显降低。(p值具有统计学意义)4.2采用RT-qPCR检测胎盘组织炎症因子的基因表达,用18s核糖体RNA作对照。LPS组和NS组、非手术对照组相比,TNF-α、IL-1β、IL-10及IL-6明显升高,LPS+DNAC组较LPS组相比,上述各炎症因子明显降低。(p值具有统计学意义)上述结果表明：LPS诱发了胎盘部位的急性炎症反应并促进了炎症因子的表达,DNAC治疗可以起到明显抑制作用。5. DNAC降低了胎盘中CD3+T细胞的浸润为研究宫内感染及DNAC治疗后母胎界面的免疫激活状况,采用免疫组化方法,用抗-CD45抗体(血细胞的marker)和抗-CD3抗体(T细胞的marker)标记,DAPI作为细胞核的标记,观察胎盘的母体面和子体面CD45+和CD3+的细胞数量(不包括血管区)。结果显示：在血管壁的周围可观察到CD3+/CD45+T细胞增多,此现象仅在LPS组观察到,在其它三组未观察到。无论是在胎盘的母体面还是子体面,LPS组较其它三组,CD3+细胞数及CD3+/CD45+细胞比值均增高。(p值具有统计学意义)。表明：DNAC抑制了外周免疫细胞于急性炎症期向胎盘组织浸润,其可能在免疫反应的早期起到了保护胎盘屏障的作用。6. DNAC减轻了LPS所致的小胶质细胞的激活状态小胶质细胞是脑组织中特化的巨噬细胞,持续的小胶质细胞的激活和脑白质发育及神经系统的损伤有关。为了确定DNAC对小胶质细胞激活的作用,我们用免疫组化方法,分析胎鼠脑皮质和脑室区小胶质细胞的激活状况；用免疫组化和流式细胞检测出生后17天的小鼠脑皮质和海马区小胶质细胞的激活状况。免疫组化结果显示,宫内感染孕鼠子代脑组织中小胶质细胞可由静止状态的分枝状变成激活状态的阿米巴样,DNAC治疗抑制小胶质细胞的激活状态；流式细胞仪分析小胶质细胞的激活状态,用抗-CD45抗体,抗-CD11b抗体及抗Iba-1抗体标记,CD11b+/CD45int用于识别小胶质细胞,Iba-1阳性表达用来识别小胶质细胞的活性状态。结果显示：Iba-1+细胞数,LPS暴露组的子代较NS组明显升高,而DNAC治疗组较LPS组明显降低。(p值具有统计学意义)。表明：LPS诱导的宫内感染可以长期持续影响子代小胶质细胞的激活,导致神经系统的不良预后；应用DNAC治疗可以保护宫内感染孕鼠子代脑组织免受损伤。结论及意义1. DNAC可能具有预防宫内感染所致孕鼠早产的作用,并且可能具有保护其子代脑神经发育的功能,为宫内感染所致早产及子代脑损伤提供了一种早期预防和干预的措施。从而推测未来产前的靶向治疗可能将给宫内感染的母胎结局带来较大影响。2. DNAC治疗宫内感染孕鼠模型的可能机制：(1)抑制胎盘部位的炎症反应,改善母胎界面的微环境；(2)抑制子代小胶质细胞的激活,减轻脑组织的炎症反应；(3)抑制胎鼠脑细胞的凋亡；(4)抑制外周免疫细胞于急性炎症期向胎盘组织浸润,推测DNAC在免疫反应的早期起到了保护胎盘屏障的作用。对进一步阐明早产发生机制及拓展DNAC的临床应用范围提供了理论依据。