自1971年Folkman提出“肿瘤生长和转移依赖于血管生成”观点以来，大量的实验研究已经从分子和基因水平予以了充分的证明，而抑制血管生成也逐渐被证明是治疗肿瘤的一条有效途径。目前，抗肿瘤血管生成的研究成为肿瘤研究的热点之一。研究认为，肿瘤中血管的来源可能有三种途径：肿瘤周围组织血管以发芽的形式形成血管；骨髓中的内皮祖细胞动员形成新生血管；间充质干细胞分化成内皮细胞形成血管。肿瘤血管生成的过程受到多种血管生成激活因子和血管抑制因子的调控，其中，VEGF是最重要的一种血管生成激活因子。力达霉素（Lidamycin，LDM）是放线菌（Streptomyces globisporus JP．C-1027）代谢产物中获得的对肿瘤细胞有强烈杀伤作用的大分子肽类抗肿瘤抗生素。本研究通过体内和体外实验从这三条途径分别对力达霉素抗肿瘤血管生成的活性和机理做了一些探讨。一、建立各种原代细胞培养方法及稳定转染GFP的肿瘤细胞株建立了人脐静脉内皮细胞（HUVEC）、大鼠脑微血管内皮细胞（rCMEC）、人脐血内皮祖细胞（EPC）、人骨髓间充质干细胞（hMSC）和大鼠骨髓间充质干细胞（rMSC）的分离培养方法，并予以了鉴定。采用稳定转染结合单克隆细胞技术，建立了4种稳定转染GFP的肿瘤细胞株，SSMC-7721-GFP、HCT116-GFP、A549-GFP、C6-GFP，为后续的肿瘤细胞与内皮细胞、间充质干细胞、成纤维细胞共培养的实验研究奠定了基础。二、力达霉素抗肿瘤血管生成的体外实验研究1．力达霉素对内皮类细胞的影响：MTT实验表明，LDM可以抑制HUVEC、rCMEC、EPC的增殖，IC₅₀值分别是3.88×10^-12M、4.33×10^-11M、7.63×10^-12M，比阿霉素、丝裂霉素、平阳霉素、紫杉醇要低10³-10⁶倍，并且，内皮类细胞对LDM比肿瘤细胞和其它正常细胞均敏感。采用三种方法检测凋亡，包括Annexin V-FITC／PI双染法、固定细胞PI单染法、固定细胞Hoechst 33342，结果表明0.1 nM-2 nM的LDM均有显著的诱导内皮细胞凋亡的作用，2 nM的LDM对HUVEC的早期凋亡率高达77.68％。在不同培养条件下培养HUVEC，并观察LDM对HUVEC增殖和凋亡的影响，实验结果表明，VEGF比bFGF有更强的促HUVEC增殖和抗凋亡作用，VEGF能小部分地拮抗LDM对HUVEC的增殖抑制和凋亡诱导作用。在内皮小管形成实验中，0.1nM-2 nM的LDM对HUVEC和EPC形成的内皮小管有显著的抑制和断裂作用；在迁移实验中，LDM对内皮细胞的划痕实验的愈合有显著的抑制作用，对HUVEC和EPC在Transwell中的迁移有显著的抑制作用，对HUVEC和EPC分泌明胶酶MMP-2和MMP-9有显著的抑制作用。浓度为0.1 nM-2 nM的LDM可以降低HUVEC的线粒体膜电位，但是对HUVEC的细胞内钙离子浓度没有明显的影响。采用基因芯片技术分析1 nM的LDM作用于HUVEC后对mRNA的影响，发现LDM可以引起与细胞凋亡、细胞周期、血管生成、细胞黏附分子、DNA聚合酶、RNA聚合酶相关的一些基因的改变，对MAPK、TGF-β、钙离子、Jak-STAT、胰岛素、Wnt等信号转导通路的基因有影响。Western Blot检测表明：LDM可以激活内皮细胞的P53凋亡信号通路，抑制抗凋亡基因Bcl-2和RB的表达，激活caspase-9和caspase-3，抑制周期调控蛋白CyclinB1和CDC2的表达，抑制ERK信号转导通路，抑制内皮细胞的VEGF／AKT、VEGF／NO信号转导通路。以上结果表明：LDM可以直接作用于内皮细胞，通过损伤内皮细胞的DNA诱导其凋亡，抑制其VEGF信号转导通路，抑制其分泌Ⅳ型胶原酶，从而抑制内皮细胞的增殖、迁移，发挥强效的抗血管生成作用。2．力达霉素对肿瘤细胞的影响：MTT实验表明，LDM可以抑制人肝癌细胞株Hep G2、人前列腺癌细胞株DU 145、人结肠癌细胞株HCT116等肿瘤细胞的增殖，IC₅₀值分别是7.74×10^-11M、2.06×10^-11M、7.66×10^-11M，比阿霉素、丝裂霉素、平阳霉素、紫杉醇要低10³-10⁵倍。采用三种方法检测凋亡，包括Annexin V-FITC／PI双染法、固定细胞PI单染法、固定细胞Hoechst 33342法，结果表明0.1 nM-2 nM的LDM均有显著的诱导Hep G2和DU 145细胞凋亡的作用，并将这两种肿瘤细胞的周期阻滞在S期和G2／M期，效应与LDM的剂量相关。在迁移、侵袭实验中，0.5 nM-2 nM的LDM对Hep G2和DU 145在Transwell中的迁移和在Matrigel中的侵袭均有显著的抑制作用，对DU 145分泌明胶酶MMP-2和MMP-9有显著的抑制作用。0.1 nM-2 nM的LDM可以降低DU 145的线粒体膜电位。采用基因芯片技术分析1 nM的LDM作用于Hep G2后对mRNA的影响，发现LDM可以引起与细胞凋亡、细胞周期、细胞黏附分子、DNA聚合酶相关的一些基因的改变，对MAPK、TGF-β、钙离子、Jak-STAT、胰岛素、Wnt等信号转导通路的一些基因有影响。Western Blot检测表明：对于野生型P53的Hep G2，LDM可以激活其P53凋亡信号通路，抑制抗凋亡基因RB的表达，抑制ERK信号转导通路；对于突变型P53和突变型RB的DU 145，LDM可以降低其P53的表达量，但对其ERK信号转导通路无明显影响。对于基因变异不同的肿瘤细胞，LDM均可以引起DNA损伤并诱导细胞凋亡，不过，它们的中间过程不尽相同。LDM可以抑制Hep G2和DU 145的周期调控蛋白Cyclin B1和CDC2的表达，与LDM的S期阻滞和G2／M期阻滞相关。LDM可以抑制多种肿瘤细胞的VEGF的表达，如Hep G2、DU 145、SSMC-7721、MCF-7、C6等。抑制VEGF的表达，一方面可以间接发挥抗血管生成的作用，另一方面抑制VEGF／VEGFR2信号转导通路可以切断肿瘤细胞的自分泌作用。以上结果表明：LDM可以抑制肿瘤细胞的增殖，并诱导其凋亡，但对不同的肿瘤细胞其作用的中间过程不尽相同。LDM可以抑制多种肿瘤细胞VEGF的表达，抑制肿瘤细胞的促血管生成的作用，发挥间接的抗血管生成作用。3．力达霉素对骨髓间充质干细胞和人胚肺成纤维细胞的影响：MTT实验和hMSC-肿瘤细胞共培养实验发现，hMSC和2BS细胞对LDM的敏感性不及内皮细胞和肿瘤细胞，这和动物实验中LDM骨髓抑制较轻的实验结果相符合。LDM可以抑制hMSC的迁移，对体外诱导hMSC向内皮方向分化有抑制作用。以上结果表明：LDM并非单纯的细胞毒药物，它的骨髓抑制的作用很小；LDM对“间充质干细胞分化成内皮细胞形成血管”这一途径有抑制作用。三、力达霉素抗肿瘤血管生成的体内实验研究力达霉素对裸鼠移植性人肝癌（Hep G2）和人前列腺癌（DU 145）的肿瘤均有显著的抑制作用，0.02 mg／kg、0.04 mg／kg和0.08 mg／kg的LDM对裸鼠移植性人肝癌HepG2的抑瘤率分别为37.1％、65.0％、72.8％；0.02 mg／kg和0.04 mg／kg的LDM对裸鼠移植性人前列腺癌DU 145的抑瘤率分别为53.3％、76.5％。免疫组化实验检测，LDM可以显著降低肿瘤的微血管密度和VEGF的表达量。移植人肝癌荷瘤裸鼠静脉注射荧光标记的内皮祖细胞和人骨髓间充质干细胞实验，并观察LDM的影响实验发现，注射EPC后可以增高肿瘤的微血管密度，而LDM对此有抑制作用。以上结果表明：LDM在体内有确切的抗肿瘤血管生成的生物学活性。四、力达霉素作用于细胞的定位性实验研究制备抗力达霉素的单克隆抗体，利用荧光显微镜和激光共聚焦显微镜检测到LDM和辅基蛋白都可以进入肿瘤细胞和内皮细胞的细胞质，LDM进入细胞后，其辅基蛋白留在细胞质中，发色团进入细胞核发挥损伤DNA及其它生物学效应。综上，力达霉素具有直接抑制内皮细胞增殖、迁移，诱导其凋亡的作用，可发挥直接的抗血管生成效应；强效的杀伤肿瘤细胞作用，以及抑制肿瘤细胞表达VEGF，可发挥间接的抗肿瘤血管生成效应。多种途径的抑制肿瘤的血管生成以及杀伤肿瘤细胞，是LDM具有显著的抗肿瘤作用的生物学基础。