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第一部分结肠癌中FLNC表达及功能的生物信息学研究目的:结肠癌的发病率不断上升,针对新靶点进行分子分型,是结肠癌精准治疗的重中之中。FLNC在胃癌、神经胶质瘤、肝癌和前列腺癌中异常表达,与肿瘤的侵袭转移密切相关,在结肠癌中发现FLNC高表达与高甲基化,但具体的作用机制尚未有相关研究。本部分利用生物信息学的手段及临床病理资料进行分析,对FLNC在结肠癌中的表达及功能做初步分析。材料与方法:收集江苏省苏北人民医院2015年6月至2016年10月90位结肠癌手术病人的癌组织及癌旁标本与匹配的临床随访资料,进行免疫组化检测结肠癌组织和癌旁组织中FLNC的表达,探究FLNC表达与临床病理特征之间关系,Cox风险比例分析探究FLNC表达对结肠癌预后的影响。利用WGCNA（Weighted Correlation Network Analysis,加权基因共表达网络分析）与GSEA（Gene Set Enrichment Analysis,基因富集分析）算法,对TCGA（The Cancer Genome Atlas,癌症基因组图谱）与CPTAC（Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium,临床蛋白质组肿瘤分析协作组）中蛋白质组学数据进行基因功能富集分析从而探究FLNC在结肠癌中的功能。使用TCGA数据库与MEXPRESS数据库中甲基化组学及RNA组学数据筛选结肠癌中对FLNC表达相关的甲基化调节因子。结果:1.免疫组化结果显示结肠癌组织FLNC的表达较癌旁组织更高（P＜0.001）。FLNC表达随肿瘤分化程度增高而降低（P＜0.05）;AJCC分期为Ⅲ期/Ⅳ期结肠癌病人的FLNC表达高于I期/II期病人（P＜0.05）;FLNC表达随结肠癌N分期增高而增高（P＜0.05）。多因素Cox风险比例分析显示FLNC是预测患者总生存情况的独立风险因素,高表达组死亡风险更高（HR=2.244（1.105—4.556）,P多因素＜0.05）。2.结肠癌蛋白质组学水平进行基因功能富集分析显示:FLNC表达在KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,基因和基因组的京都百科全书）中为黏着斑,ECM（Extracellular Matrix,细胞外基质）-受体作用等通路显著富集,GO（Gene Ontology）功能注释分析中细胞-基质粘附等生物学过程相关;FLNC定位在粘着斑,细胞-基质连接等结构中;FLNC与肌动蛋白结合、肌动蛋白丝结合等分子功能相关。3.基于TCGA-COAD和CPTAC-colon蛋白组学数据集的GSEA结果显示FLNC表达与EMT（Epithelial-Mesenchymal Transition,上皮间充质转化）相关（P＜0.001）,FLNC表达与EMT标志物表达正相关（R=0.5,P＜0.001）。4.MEXPRESS与TCGA中筛选FLNC表达的甲基化调节靶点,显示甲基化位点cg00734629甲基化程度与FLNC m RNA显著负相关（R=-0.39,P＜0.001）,Kaplan-Meier生存曲线显示cg00734629高甲基化水平患者预后更好（HR=4.03（1.21-13.39）,logrank P=0.014）;进一步筛选调节cg00734629的甲基化调节因子,结果显示:cg00734629与甲基化调节因子ZBTB4（P＜0.001）负相关;FLNC表达受到甲基化调节因子ZBTB4的正向调节:FLNC m RNA表达与ZBTB4显著正相关（R=0.473,P＜0.001）。结论:1.结肠癌组织FLNC的表达高于癌旁组织;FLNC的表达随分化程度增高而降低,随肿瘤分期的增高而增加,随肿瘤的N分期增高而增加。2.FLNC是预测COAD患者总生存时间的独立风险因素,FLNC表达水平越高,患者预后越差。3.功能富集分析显示FLNC表达在黏着斑与细胞-基质连接中,与EMT标志物正相关。4.结肠癌中ZBTB4可能通过下调cg00734629的甲基化程度来促进FLNC的表达。第二部分FLNC通过Rac1诱导结肠癌细胞EMT形成并促进结肠癌侵袭转移的机制研究目的:本研究第一部分进行功能富集分析显示FLNC的表达与侵袭迁移及EMT相关,甲基化分析显示ZBTB4可能通过下调cg00734629的甲基化程度来调节FLNC的表达。前期研究发现FLNC可以通过调节Rho-GTPase活性促进淋巴侵袭迁移,而Rho-GTPase是肿瘤EMT中TGFβ通路重要分子。在本部分中我们将进行体内及体外实验对第一部分内容进行验证,对FLNC通过Rac1诱导结肠癌细胞EMT形成并促进结肠癌侵袭转移的机制进行研究。方法:使用si RNA瞬时转染在HCT116与SW480细胞中敲低了FLNC/ZBTB4,通过荧光显微镜下观察转染效果。WB（Western Blot,免疫蛋白印迹）或PCR（Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应）验证显示敲低组的FLNC/ZBTB4/Rac1/EMT标志物表达情况。CCK8实验检测FLNC敲低后细胞增殖能力的变化。Transwell迁移及侵袭实验检测FLNC敲低后细胞迁移侵袭能力的变化。免疫荧光染色观察FLNC敲低后细胞中EMT相关标志物的表达的变化。裸鼠皮下成瘤实验观察敲低ZBTB4对HCT116体内生长增殖的影响。结果:1.FLNC敲低后抑制HTC116与SW480中GTP-Rac1活性。2.FLNC敲低组的细胞增殖活力在48h（HCT116＆SW480,P＜0.05）、72h（HCT116＆SW480,P＜0.05）较正常组下降;GTP-Rac1抑制剂NSCC23766（+）细胞的增殖细胞数量较NSCC23766（-）下降（HCT116＆SW480,P＜0.05）。3.FLNC敲低组HCT116与SW480细胞迁移能力降低（HCT116＆SW480,P＜0.05）,侵袭能力降低（HCT116＆SW480,P＜0.05）;HCT116与SW480细胞中NSCC23766（+）组的迁移能力较NSCC23766（-）降低（HCT116＆SW480,P＜0.05）,侵袭能力降低（HCT116＆SW480,P＜0.05）。4.在HCT116中敲低FLNC后,免疫荧光染色显示EMT标志物E-钙黏蛋白表达增加,波形蛋白降低。NSCC23766（+）组HCT116中较NSCC23766（-）组相比,WB显示E-钙黏蛋白表达增加,波形蛋白降低。5.HTC116与SW480细胞系中使用si RNA敲低ZBTB4后,PCR结果显示FLNC-m RNA表达明显下降（HCT116＆SW480,P＜0.05）;ZBTB4敲低后,使用HCT116细胞系裸鼠皮下成瘤曲线显示:重量及体积较正常对照组减少（重量＆体积,P＜0.05）,瘤体免疫组化染色显示FLNC表达较正常组降低（P＜0.05）。结论:1.敲低FLNC可以靶向抑制GTP-Rac1活性进而抑制结肠癌EMT改变并抑制癌细胞增殖、侵袭和迁移。2.敲低ZBTB4后下调FLNC的表达,可抑制裸鼠皮下种植瘤的生长和增殖。