研究背景及目的:咳嗽是急性上呼吸道感染(URI)最突出的的症状。急性咳嗽定义为咳嗽在3周以内,URI是其最常见的原因。而感染后咳嗽是患者在经历了急性URI之后,感染本身症状消失,咳嗽仍然迁延不愈,持续时间大于3周而胸部X线检查正常,又称感冒后咳嗽,一般由病毒感染引起,以副流感病毒(PIV)和呼吸道合胞病毒(RSV)较为常见。URI之后,大约有11%～25%的人患感染后咳嗽。然而,对于病毒感染引起的咳嗽,目前仍然缺乏满意的治疗。至今,有关感染后咳嗽的真正机制知之甚少,还没有真正病毒性咳嗽的动物研究。因此,进行病毒感染引起的咳嗽,尤其是感染后咳嗽发病机制的研究将有助于揭露疾病的本质,对提供治疗方向具有相当重要的意义。咳嗽反射敏感性(CRS)异常增高是机体咳嗽反应的一个十分重要的原因。由感觉神经末梢(主要是C纤维末梢)释放的神经肽所介导的神经源性炎症可能在CRS改变以及咳嗽发病中起重要作用。病毒感染可以通过多种机制引起神经肽水平升高。有临床研究发现,URI后咳嗽患者CRS升高是其主要特征。但是,迄今为止,针对URI引起的CRS改变的研究,仅限于少数报道。那么,在病毒感染引起的咳嗽中,CRS如何改变?CRS与气道神经源性炎症之间关系如何?神经肽是否参与以及哪些神经肽起主要作用呢?为了更好地阐述这些问题,本研究将通过制作豚鼠人副流感病毒三型(PIV3)和RSV感染咳嗽模型,动态观察豚鼠CRS的改变和气道神经源性炎症,以及它们之间的关系,从多方面深入探讨病毒感染引起的咳嗽,尤其是感染后咳嗽的发病机制。主要结果及结论:SPF级豚鼠随机分成十组,即正常对照组,两个病毒感染组以及哮喘组,每个感染组又按病毒感染后天数分为6, 12, 28和42天四个组。每组十只。1.分别制作PIV3和RSV感染豚鼠咳嗽模型,免疫荧光和荧光定量PCR(FQ-PCR)方法分别检测病毒抗原和核酸,证实PIV3和RSV成功感染豚鼠;支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞学及肺组织病理学显示感染组急性期以气道炎症改变为主,未见肺实质炎症。表明豚鼠PIV3和RSV感染急性和感染后咳嗽模型成功建立。2.辣椒素咳嗽激发试验结果显示所有感染组CRS均明显增高,与URI引起的咳嗽的临床特点相符,急性感染期部分豚鼠伴气道高反应性(AHR)。哮喘对照组模型气道反应性(AR)明显增加而CRS无明显改变。3. PIV3模型豚鼠各组肺组织P物质(SP)含量,12、28和42天组神经肽受体1(NK1)及各组辣椒素受体亚型1(VR1)的mRNA水平均明显上升。6、12和28天组SP,42天组蛋白基因产物(PGP-9.5),28和42天组VR1及神经丝(NF)200的蛋白表达明显增强,提示引起了神经源性炎症。4. RSV模型豚鼠各组肺组织SP含量,12、28和42天组NK1以及6、12和28天组VR1的mRNA水平均明显升高;12和28天组SP、28天组VR1以及12天组PGP-9.5的蛋白表达均明显增强,同样提示引起了神经源性炎症。5.两种咳嗽模型豚鼠CRS及神经肽的变化均呈一定的时空分布特点,PIV3和RSV核酸含量均随感染后时间延长逐步明显降低,感染性气道炎症则逐渐恢复;而CRS、SP含量以及NK1和VR1的基因表达普遍达到高峰或维持较高水平,神经肽的蛋白表达则多在28天前后显著增强。均提示神经源性炎症可能在感染后咳嗽的发病中起重要作用。6. PIV3模型豚鼠6和28天组肺组织SP含量,12、28和42天组NK1及各组VR1的mRNA水平均与CRS呈正相关;而6、12和42天组SP,12和28天组VR1,12天组PGP9.5以及28天组NF-200的蛋白表达与CRS呈正相关。RSV模型豚鼠各组肺组织SP含量和NK1以及12、28天组VR1的mRNA水平均与CRS呈正相关;而6、12和28天组SP以及6、28天组PGP9.5的蛋白表达与CRS呈正相关。7.两种模型均发现多数神经肽及相关受体与CRS呈正相关,提示可能是CRS增高的重要因素;而神经肽及相关受体引起的气道神经源性炎症可能是病毒感染性咳嗽,尤其是感染后咳嗽的关键机制。总结与展望:PIV3和RSV感染均可以制作较为理想的病毒感染咳嗽动物模型,两种模型特征和机制基本相似,均提示CRS增高并伴随以SP为主的神经肽及受体含量升高和表达增强为特点的气道神经源性炎症是病毒感染性咳嗽的重要特征。阻断神经源性炎症过程,降低CRS,有望成为未来病毒感染性咳嗽一个主要治疗靶点。第一部分豚鼠副流感病毒感染急性和感染后咳嗽模型的建立目的:建立豚鼠PIV3感染急性和感染后咳嗽模型,通过动态观察感染后豚鼠CRS、AR及气道炎症变化,验证模型的成功性。方法:1.豚鼠60只,随机分成正常对照组,病毒感染组以及哮喘对照组,感染组按病毒感染后天数又分为6, 12, 28和42天四个组。每组十只。2. PIV3经体外细胞培养扩增并收获后,通过滴鼻方法接种于实验豚鼠呼吸道,正常对照组接种细胞及病毒培养用培养基;哮喘组豚鼠不予接种,而予卵白蛋白致敏和诱发哮喘。3.免疫荧光技术和FQ-PCR方法分别检测PIV3抗原和核酸。4.用BUXCO肺功能仪通过辣椒素和乙酰胆碱刺激测定CRS及AR。5. BALF细胞学和肺组织病理学检查观察豚鼠气道炎症。结果:1.免疫荧光检测显示PIV3感染细胞和大多数6及12天组豚鼠肺组织均可见病毒抗原表达。感染组豚鼠肺组织PIV3 RNA含量在感染后6天组浓度最高,随着感染后时间推移呈明显逐步降低趋势。2.不同时间的病毒感染组豚鼠CRS均较正常对照组(2.50±0.45)明显升高(P<0.05),其中42天组升高(8.40±2.35)最为明显(P<0.01);6天组豚鼠AR对两个高浓度MeCh明显增加(P<0.05);哮喘组豚鼠虽然AR对各个浓度MeCh均明显升高,但CRS升高无显著意义。3. BALF细胞学结果显示感染和哮喘组豚鼠细胞总数均有明显不同程度的升高,感染后6和第12天组豚鼠淋巴细胞(Lymph)明显升高(P<0.01);而哮喘组豚鼠嗜酸性粒细胞(Eos)显著高于感染组(P<0.001)。4.肺组织病理学显示感染组豚鼠急性期以气道的炎症表现为主,随感染后时间延长逐渐恢复,未发现明显的肺实质炎症。结论:1.本部分研究制作的PIV3感染豚鼠咳嗽模型中,病毒学检查证实PIV3成功感染。2.模型豚鼠各时间组CRS均明显增高,与URI引起的咳嗽的临床特点相符。3. BALF细胞学及肺组织病理学均支持急性期气道病毒性炎症改变,而肺实质炎症不明显。以上表明豚鼠PIV3感染急性和感染后咳嗽模型均成功建立,为进一步研究病毒感染引起咳嗽的发病机制提供了基础。第二部分豚鼠副流感病毒感染咳嗽模型的神经源性炎症机制探讨目的:探讨PIV3感染豚鼠咳嗽模型CRS增高的机制及其神经源性炎症在CRS增高及咳嗽发病中的的作用。方法:1.在前文成功建立的PIV3感染豚鼠咳嗽模型基础上,分别进行下列研究:2. ELISA法检测豚鼠肺组织匀浆的SP蛋白含量;3. FQ-PCR方法检测豚鼠肺组织NK1、VR1的mRNA表达水平;4.免疫组化方法检测豚鼠肺组织SP、VR1、PGP-9.5和NF-200的蛋白表达及半定量分析;5.上述神经肽蛋白含量、基因表达和蛋白表达各自与CRS的相关性分析。结果:1.模型豚鼠肺组织匀浆中的SP含量自感染后6天组(31.95±6.35)pg/mg起即有显著高于对照组(19.5±4.68)并达到最高峰(P<0.01),此后直至感染后42天组(27.12±5.0)均维持在高水平(P<0.05)。2. 12、28和42天组豚鼠肺组织NK1的mRNA水平较对照组明显上调,于感染后28天组达到高峰(P<0.01),到感染后42天组仍维持高水平。所有感染组VR1的mRNA表达较对照组均有明显升高,而在12和28天组升高更为突出(P<0.01)。3.肺组织SP、VR1、PGP-9.5及NF-200蛋白的免疫组化半定量分析结果:3.1与对照组相比,感染组SP阳性表达在感染后6、12及28天组都明显增强(P<0.05),以28天组增强最为明显(P<0.01);而在感染后42天组有所下降,差异已无显著性。3.2感染后28和42天组VR1表达较对照组明显增强(P<0.05)。感染后42天组PGP-9.5表达较对照组增强(P<0.05)。3.3与对照组相比,感染组NF-200蛋白表达随着感染后时间延长而逐渐增强,虽在6和12天组增强无显著意义,但在28天组的表达达最高峰(P<0.01),在42天组表达仍很强(P<0.05)。4.豚鼠CRS与神经肽及受体的相关性分析:4.1在感染后6和28天组,豚鼠CRS与肺匀浆SP含量呈正相关;在感染后12、28和42天组,豚鼠CRS与NK1mRNA水平呈正相关;各感染组CRS均与VR1mRNA水平呈正相关。4.2在感染后6、12和42天组,豚鼠CRS均与SP的蛋白表达呈正相关;在感染后12和28天组,豚鼠CRS与VR1蛋白表达呈正相关;在12天组与PGP-9.5表达显著正相关;仅在28天组与NF-200表达有相关性。结论:1.模型豚鼠SP含量、NK1和VR1mRNA水平明显升高,多数SP及部分VR1、PGP-9.5和NF- 200蛋白表达明显增强,提示引起了神经源性炎症。2.神经肽的变化呈现一定的时空分布,病毒核酸含量逐步降低,气道炎症逐渐恢复;而SP含量仍维持在很高水平,NK1和VR1基因表达在28天达到高峰,多数神经肽蛋白在28或42天表达显著增强。3.多数感染组神经肽及受体的含量和表达与CRS呈正相关,可能是引起后者增高的重要因素。以上表明,由SP等神经肽及相关受体引起的气道神经源性炎症,在PIV3感染性咳嗽,尤其是感染后咳嗽发病机制中起决定作用。第三部分豚鼠呼吸道合胞病毒感染咳嗽模型的建立及其神经源性炎症机制探讨目的:建立豚鼠RSV感染咳嗽模型,探讨RSV感染咳嗽模型神经源性炎症及其在咳嗽发病中的的作用。方法:1.豚鼠40只,随机分成RSV感染6, 12, 28和42天组;正常对照组和哮喘对照组同前。接种方法均同前。2.直接、间接免疫荧光技术和FQ-PCR方法分别检测RSV抗原和核酸。3.用BUXCO肺功能仪测定CRS及AR。豚鼠BALF中细胞学和肺组织病理学检查观察气道炎症。4.模型建立成功后,ELISA法检测豚鼠肺组织匀浆的SP蛋白含量。5. FQ-PCR方法检测豚鼠肺组织NK1、VR1的mRNA表达水平。6.免疫组化方法检测豚鼠肺组织SP、VR1及PGP-9.5的蛋白表达及半定量分析。7.神经肽蛋白含量、基因表达和蛋白表达各自与CRS的相关性分析。结果:1.免疫荧光检测显示RSV感染细胞和大多数6及12天组豚鼠肺组织可见病毒抗原表达。感染组豚鼠肺组织RSV RNA含量在感染后6天组浓度最高,随着感染后时间推移明显呈逐步降低趋势。2.从RSV感染开始6天组(8.00±1.22)起,CRS即较正常对照组明显升高(P<0.01),并在12天组(8.70±1.96)达到最高峰(P<0.01),感染后28和42天组(7.60±1.39,6.70±1.17)仍较正常对照组明显升高(P<0.05)。感染后12天组豚鼠AR对两个高浓度MeCh刺激有明显增加(P分别<0.05和0.01);而哮喘组豚鼠对每个MeCh浓度的均有明显AHR。3. BALF细胞学显示,感染后6、12和28天组及哮喘组炎症细胞总数均有明显升高;分类计数中,感染后6和12天组Lymph数明显升高(P<0.05),而哮喘组则以Eos明显增加为主(P<0.05)。肺组织病理学显示,感染组在急性期以气道炎症表现为主,未见明显肺实质的炎症。4.感染组肺组织匀浆SP含量从6和12天组起即显著高于对照组(P<0.05),在感染后28天组(38.72±14.24)达到最高峰(P<0.01),42天组(37.51±13.43)仍维持在很高水平(P<0.01)。5.感染后12、28和42天组肺组织NK1 mRNA水平均明显上调(P<0.05)。6、12和28天组VR1 mRNA水平均较对照组明显上调(P<0.05)。6.肺组织SP、VR1及PGP-9.5蛋白的免疫组化半定量分析结果:感染组SP蛋白表达在感染后12及28天组较正常对照组显著增强(P<0.05)。28天组VR1和12天组PGP-9.5的表达较对照组显著增强(P<0.05)。7.豚鼠CRS与神经肽及受体的相关性分析:各感染组肺匀浆SP含量和NK1 mRNA水平均与CRS呈正相关;12和28天组VR1mRNA水平与CRS密切正相关。CRS与6、12和28天组SP蛋白表达呈正相关,而与VR1表达均不相关;6和28天组PGP-9.5与CRS呈正相关。结论:1.本部分研究制作了豚鼠RSV感染咳嗽模型。病毒学检查证实RSV成功感染豚鼠。各感染组CRS均明显增高,同URI引起咳嗽的临床特点一致。BALF细胞学及组织病理学检查支持急性期气道炎症改变,而肺实质炎症不明显,表明豚鼠RSV感染急性和感染后咳嗽模型成功建立。2.感染组豚鼠SP含量、NK1和VR1mRNA水平明显升高,SP、VR1和PGP-9.5蛋白表达明显增强,提示引起了神经源性炎症;而且它们大多与CRS相关。CRS和神经肽的变化呈现一定的时空分布特征,病毒核酸含量逐步降低,气道炎症逐渐恢复,而CRS、神经肽含量及基因表达却达到高峰或仍维持在较高水平,蛋白表达则多在12和28天显著增强。表明SP等神经肽及相关受体引起的气道神经源性炎症是病毒感染性咳嗽,尤其是感染后咳嗽的关键机制。