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狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies Virus, RV)引起的人兽共患急性高度致死性传染病。核蛋白是RV最保守的蛋白,可激发机体产生抗病毒核衣壳抗体,因此可作为血清学特异诊断的抗体。Bac-to-Bac表达系统主要有两种,AcNPV和BmNPV,前者主要以Spodoptera frugiperda和Trichoplusia ni为宿主,而后者只感染家蚕及其细胞系,具有良好的生物安全性。依托Bac-to-Bac表达系统,本试验以RVERA毒株为模板,经RT-PCR克隆出NP基因,并利用杆状病毒表达载体系统表达了狂犬病病毒核蛋白,将纯化的核蛋白作为包被抗原,建立了狂犬病病毒NP重组蛋白的间接ELISA抗体检测方法,具体结果如下：1.通过RT-PCR克隆狂犬病病毒ERA株核蛋白基因,将N基因克隆到杆状病毒转座载体质粒pFastBacHTB中,构建重组质粒pFastBacHTB-NP,再将重组质粒转化DH10Bac/AcNPV感受态细胞,经三重抗性和蓝白斑筛选,获得核蛋白的杆状病毒表达质粒rBacmid/AcNPV/NP;通过转染sf9昆虫细胞包装成重组杆状病毒RV-AcNPV-N。将F1代重组病毒接种sf9单层细胞72h后,细胞出现明显病变,进行IFA、SDS-PAGE、Western-blot检测。结果表明,当感染细胞用鼠抗RV核蛋白单克隆抗体和RV阳性血清检测时,能出现特异性的绿色荧光。当进行SDS-PAGE和Western-blot时,目的蛋白以胞内方式进行表达,并能与鼠抗RV核蛋白单克隆抗体和RV阳性血清发生特异性反应,表达蛋白的相对分子量为50.5kd。2.将重组质粒pFastBacHTB-NP转化DH10Bac/BmNPV感受态细胞,经三重抗性和蓝白斑筛选,获得核蛋白的杆状病毒表达质粒rBacmid/BmNPV/NP;通过转染BmN昆虫细胞包装成重组杆状病毒RV-BmNPV-N。将F1代重组病毒一方面大批量接种于BmN细胞表达重组核蛋白,出现明显细胞病变；另一方面,直接感染5龄家蚕,病毒随之进入血淋巴并引起家蚕病变,收集病变家蚕的血淋巴。进行IFA、SDS-PAGE、Western-blot检测。结果表明,当感染的家蚕细胞用鼠抗RV核蛋白单克隆抗体和RV阳性血清检测时,能出现特异性的绿色荧光。当对家蚕细胞和家蚕上表达蛋白进行SDS-PAGE和Western-blot时,目的蛋白能与鼠抗RV核蛋白单克隆抗体和RV阳性血清发生特异性反应,表达蛋白的相对分子量为51.5kd,且在目的蛋白下方还有一明显的特异性条带,说明该系统能对表达蛋白进行有效的加工和修饰。3.核蛋白AcNPV-NP和BmNPV-NP均以胞内方式进行表达。在蛋白纯化前用Lysis Buffer悬浮细胞沉淀,超声裂解后离心,核蛋白以可溶形式存在于裂解上清中,取上清加入NI柱与NI-NTA充分混合均匀,用Wash Buffer洗涤NI柱,Elution Buffer洗脱蛋白,收集的各管用于SDS-PAGE分析和Western-blot检测,结果获得高纯度的重组RV核蛋白AcNPV-NP和BmNPV-NP,在sf9细胞和家蚕细胞上的产量分别为15.8μg/ml和18.1μg/ml,而在家蚕幼虫中的产量为180μg/ml,约为家蚕细胞上表达量的10倍,表明BmNPV系统表达的核蛋白量高于AcNPV表达系统。4.以Bac-To-Bac/BmNPV杆状病毒表达系统表达的狂犬病病毒核蛋白为抗原,建立了检测狂犬病病毒抗体的BmNPV-NP-ELISA方法,并确定了ELISA最佳工作条件：抗原包被液为0.05M pH 8.5的Tris-HCl缓冲液,抗原包被浓度为4μg/ml;封闭液为5%脱脂奶/PBS,血清稀释液为含0.05% tween-20的磷酸缓冲液,待检血清的最佳稀释倍数为1：100,反应条件为37℃,45min酶标二抗孵育时间为37℃,30min,底物溶液显色条件为37℃显色8min。敏感性试验结果表明：BmNPV-NP-ELISA的效价为1:640-1:1280。重复性试验结果显示：同批抗原制备的不同检测板的批内变异系数(CV)值在3.2%-7.9%之间,不同批抗原制备的检测板的批间变异系数(CV)值在2.9%-9.9%之间。对143份犬临床血清的检测表明,该方法重复性好、灵敏度高；以重组杆状病毒表达的核蛋白为抗原建立的BmNPV-NP-ELISA与美国进口试剂盒比较,诊断敏感性为89.36%;诊断特异性为87.50%;总符合率为88.11%。