【摘 要】
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目的：构建真核表达质粒PIRES-Ag85B,通过酶切鉴定和测序鉴定后在CHO细胞中进行表达,并用Western-blot检测表达结果,为开发新型的结核病疫苗和结核病血清免疫诊断试剂奠定基础
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目的：构建真核表达质粒PIRES-Ag85B,通过酶切鉴定和测序鉴定后在CHO细胞中进行表达,并用Western-blot检测表达结果,为开发新型的结核病疫苗和结核病血清免疫诊断试剂奠定基础。方法：根据GenBank上结核分枝杆菌Ag85B基因的CDS序列,应用primer premier5.0设计一对引物,分别在引物5’端引入Nhe I和EcoR I酶切位点及保护碱基。从结核分枝杆菌标准株H37Rv中提取基因组DNA,应用引物,扩增Ag85B基因片段,用PCR回收试剂盒割胶回收后纯化PCR产物,双酶切PCR产物及真核表达质粒PIRES,经T4DNA连接酶连接后转化DH5α感受态细胞,用氨苄青霉素筛选阳性克隆后,再经PCR,双酶切和测序进行鉴定。应用脂质体转染技术,将重组质粒PIRES-Ag85B转染CHO细胞,48小时后用G418进行筛选,并用Western blot检测Ag85B的基因表达。结果：从结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA中扩增出978bp的Ag85B基因,并成功构建真核表达质粒PIRES-Ag85B,经Nhe I和EcoR I双酶切后电泳获得61,000bp和978bp的条带,与预期结果一致,经测序证实获得目的基因序列与GenBank公布的一致,转染CHO细胞后获得稳定表达Ag85B的CHO细胞株,用Western blot方法在蛋白水平检测Ag85B的基因表达。结论：1从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Ag85B基因片段并成功构建真核表达质粒PIRES-Ag85B。2 Ag85B目基因在CHO细胞中获得表达。图：14表：1参：49
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